به نام خدا معاونت پژوهش وفن آوری منشور اخلاق پژوهش با یاری از خداوند سبحان واعتقاد به این که عالم محضرخداست وهمواره ناظر براعمال انسان و به منظور پاس داشت مقام بلند دانش و پژوهش و نظر به اهمیت جایگاه دانشگاه دراعتلای فرهنگ وتمدن بشری ، مادانشجویان واعضاء هیأت علمی واحدهای دانشگاه آزاد اسلامی متعهد می گردیم اصول زیر را درانجام فعالیت های پژوهشی مد نظر قرارداده وازآن تخطی نکنیم : اصل برائت : التزام به برائت جویی از هرگونه رفتار غیر حرفه ای واعلام موضع نسبت به کسانی که حوزه علم وپژوهش ر ابه شائبه های غیرعلمی می آلایند . اصل رعایت انصاف وامانت : تعهد به اجتناب ازهرگونه جانبداری غیرعلمی وحفاظت ازاموال ، تجهیزات ومنابع دراختیار. اصل ترویج : تعهد به رواج دانش واشاعه نتایج تحقیقات وانتقال آن به همکاران علمی و دانشجویان به غیر ازمواردی که منع قانونی دارد . اصل احترام : تعهد به رعایت حریم ها وحرمت ها درانجام تحقیقات ورعایت جانب نقد وخودداری ازهرگونه حرمت شکنی . اصل رعایت حقوق : التزام به رعایت کامل حقوق پژوهشگران و پژوهیدگان (انسان ، حیوان ونبات ) وسایرصاحبان حق . اصل راز داری : تعهد به صیانت ازاسرار واطلاعات محرمانه افراد ، سازمان ها وکشوروکلیه افراد ونهادهای مرتبط با تحقیق . اصل حقیقت جویی : تلاش درراستای پی جویی حقیقت و و فاداری به آن ودوری ازهرگونه پنهان سازی حقیقت. اصل مالکیت مادی ومعنوی : تعهد به رعایت کامل حقوق مادی و معنوی دانشگاه و کلیه همکاران پژوهش. اصل منافع ملی : تعهد به رعایت مصالح ملی و درنظر داشتن پیشبرد وتوسعه کشور درکلیه مراحل پژوهش. 0000 دانشگاه آزاد اسلامی واحد دامغان دانشکده علوم پایه پایان نامه کارشناسی ارشد رشته زیست شناسی گرایش بیوشیمی عنوان: بررسی ارزش تشخیصی روش های بیوشیمیایی (ADA و IFN-γ) و میکروبی برای تشخیص سل در نمونه ی پلور بیماران مبتلا به سل فعال پلور در شهر تهران استاد راهنما: دکتر سعید ذاکر بستان آباد استاد مشاور: دکتر سکینه سعیدی سار نگارنده: نازنین میرمحسنی نمینی دی ماه 1393 فهرست مطالب چکیده1فصل اول- کلیات31-1 تاریخچه ی بیماری سل31-2 عامل بیماری زا - مایکوباکتری41-2-1 مایکوباکتریوم توبرکلوزیس51-2-2 اجزای تشکیل دهنده ی دیواره ی سلولی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس51-3 بیماری زایی61-3-1 فاکتور طنابی71-4 انتقال باسیل سل به انسان71-5 روند بیماری سل81-6 واکنش ایمنی نسبت به سل91-6-1 تماس و عفونت اولیه91-6-2 ظهور کانون ثانویه131-7 انواع سل141-7-1 سل ریوی141-7-2 سل خارج ریوی151-7-2-1 سل پلور151-7-2-2 تظاهرات بالینی ناشی از سل پلور161-8 روش های تشخیصی بیماری سل171-8-1 روش میکروسکوپی-رنگ آمیزی زیل نلسن171-8-2 کشت191-8-2-1 محیط کشت لوون اشتاین جنسن191-8-2-2 خصوصیات رشد201-9 تشخیص سل پلور211-9-1 سنجش اینترفرون گاما211-9-1-1 تکنیک الایزا231-9-1-2 وسایل و تجهیزات مورد نیاز در روش الایزا231-9-1-3 روش الایزا ی ساندویچ251-9-2 آنزیم آدنوزین دی آمیناز261-9-2-1 ویژگی های آدنوزین دآمیناز261-9-2-2 متابولیسم آدنوزین دآمیناز271-9-2-3 سنجش فعالیت آدنوزین دآمیناز281-10 هدف از انجام مطالعه28فصل دوم- مروری بر سوابق تحقیق292-1 سوابق تحقیق29فصل سوم- روش انجام کار353-1 اقدامات ایمنی353-2 جمع آوری و انتقال نمونه363-3 آماده سازی نمونه383-3-1 آلودگی زدائی383-3-1-1 هضم و آلودگی زدائی به روش پتروف393-3-2 خنثی سازی403-4 تهیه ی گسترش از نمونه ی مایع پلور413-5 رنگ آمیزی413-5-1 رنگ امیزی زیل نلسن423-5-1-1 ساخت رنگ فوشین423-5-1-2 مرحله ی رنگ بری-ساخت محلول رنگ بر433-5-1-3 رنگ زمینه443-6 بررسی و گزارش نتیجه ی لام453-7 کشت493-7-1 روش ساخت محیط کشت لوون اشتاین جنسن493-7-1-1 مخلوط یکنواخت تخم مرغ493-7-1-2 محلول نمکی503-7-1-3 محلول مالاشیت گرین503-7-2 منعقد نمودن محیط523-8 انجام کشت نمونه ی مایع پلور533-9 بررسی و جوابدهی نتیجه ی کشت573-9-1 جدول زمانی بررسی کشت573-9-2 بررسی منظره ی ماکروسکوپی کشت573-9-3 خواندن کشت و ثبت نتایج583-10 اندازه گیری غلظت اینترفرون گاما در نمونه ی پلور بیماران583-10-1 اجزای موجود در کیت الایزا593-10-2 نمونه های مناسب جهت بررسی603-10-3 رقیق سازی محلول استاندارد603-10-4 روش کار-تلقیح نمونه623-10-5 اساس تست623-10-6 مراحل انجام تست643-10-6-1 چاهک بلانک643-10-6-2 چاهک های استاندارد643-10-6-3 چاهک های نمونه643-10-6-4 تهیه ی محلول شستشو643-10-6-5 شستشو643-10-6-6 ایجاد رنگ653-10-6-7 توقف واکنش653-10-7 فرایند اندازه گیری663-11 تعیین میزان فعالیت آنزیم آدنوزین دی آمیناز663-11-1 اجزای تشکیل دهنده ی کیت آدنوزین دآمیناز663-11-2 اساس واکنش683-11-3 اتوآنالایزر693-11-3-1 قسمت های تشکیل دهنده ی دستگاه اتوآنالایزر703-11-3-2 رویه ی تست برای دستگاه هیتاچی733-11-4 محدودیت ها در طی فرایند اندازه گیری733-11-5 خواندن نتایج73فصل چهارم- یافته ها و نتایج744-1 نتایج مطالعه ی میکروسکوپی754-2 نتایج کشت754-3 نتایج تست الایزا جهت سنجش غلظت اینترفرون گاما764-4 نتایج حاصل از بررسی فعالیت آدنوزین دآمیناز80فصل پنجم- بحث و جمع بندی855-1 بحث855-2 جمع بندی915-3 پیشنهادات93چکیده انگلیسی101 فهرست شکل شکل 1-1 ساختمان دیواره ی سلولی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ................................................................ 6 شکل 1-2 کنترل تکثیر مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در بافت ریه ................................................................. 11 شکل 1-3 تشکیل گرانولوما در پی عفونت اولیه با مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ............................................ 11 شکل 1-4 محل ضایعه ی اولیه، ضایعات گرانولوماتوز در بافت ریه ........................................................... 12 شکل 1-5 نمایش حفره ی سلی در بافت ریه .............................................................................................. 13 شکل 1-6 نمایش کلی از آسیب زائی در عفونت با مایکوباکتریوم توبرکلوزیس ........................................... 14 شکل 1-7 رادیوگراف قفسه ی سینه در بیمار آلوده به سل جنبی .................................................................. 16 شکل 1-8 نمایش بافت ریه، جنب و تراوش جنبی ناشی از سل ................................................................... 17 شکل 1-9 باسیل های اسید فست در نمونه ی خلط پس از رنگ آمیزی زیل نلسن ....................................... 18 شکل 1-10 محیط کشت لوون اشتاین جنسن ............................................................................................... 20 شکل 1-11 کلونی های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس بر روی محیط کشت لوون اشتاین جنسن ..................... 21 شکل 1-12 تصویری شماتیک از اساس تست الایزای ساندویچ .................................................................... 25 شکل 1-13 آنزیم آدنوزین دآمیناز و دِآمینه شدن آدنوزین به اینوزین ............................................................. 26 شکل 3-1 هود کلاس 2 .................................................................................................................................. 36 شکل 3-2 چگونگی خارج نمودن مایع جنب از بیمار .................................................................................... 37 شکل 3-3 نمونه ی مایع پلور ........................................................................................................................ 38 شکل 3-4 کاغذ pHسنج ................................................................................................................................. 40 شکل 3-5 مرحله ی اول رنگ آمیزی زیل نلسن ............................................................................................ 43 شکل 3-6 مرحله ی دوم رنگ آمیزی زیل نلسن ........................................................................................... 44 شکل 3-7 مرحله ی آخر رنگ آمیزی زیل نلسن .......................................................................................... 45 شکل 3-8 نمونه ی لام رنگ آمیزی شده به روش زیل نلسن از نمونه ی مایع پلور ..................................... 46 شکل 3-9 تصویر رنگ آمیزی شده ی باسیل سل ......................................................................................... 47 شکل 3-10 معادل سازی ابعاد گستره با تعداد میدان میکروسکوپی قابل بررسی ........................................... 48 شکل 3-11 مراحل ساخت مخلوط یکنواخت تخم مرغ برای ساخت محیط لوون اشتاین جنسن ................ 49 شکل 3-12 مواد مورد استفاده جهت ساخت محلول نمکی .......................................................................... 50 شکل 3-13 محلول مالاشیت گرین .............................................................................................................. 51 شکل 3-14 مراحل ساخت محیط لوون اشتاین جنسن .................................................................................. 52 شکل 3-15 منعقد نمودن محیط ها در دستگاه منعقد کننده ........................................................................... 53 شکل 3-16 قرار گرفتن محیط های کشت به صورت مورب در انکوباتور .................................................... 54 شکل 3-17 ظروف مخصوص اتوکلاو و حاوی ضایعات آلوده ی بخش مایکوباکتریولوژی ........................ 55 شکل 3-18 فلوچارت مراحل تهیه ی اسمیر و کشت از نمونه ی مایع پلور ................................................. 56 شکل 3-19 تصویر کلونی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در محیط لوون اشتاین جنسن .................................. 57 شکل 3-20 تصویر کیت الایزا برای سنجش اینترفرون گامای انسانی ........................................................... 60 شکل 3-21 رقیق سازی محلول استاندارد ..................................................................................................... 61 شکل 3-22 جداسازی نمونه های مایع پلور در میکروتیوب های استریل ..................................................... 62 شکل 3-23 اساس تست الایزای ساندویچ .................................................................................................... 63 شکل 3-24 تلقیح نمونه و معرف های کیت در چاهک های الایزا .............................................................. 65 شکل 3-25 کیت تجاری Diazyme® جهت اندازه گیری فعالیت آنزیم ADA ............................................ 67 شکل 3-26 واکنش انجام شده در اندازه گیری ADA ................................................................................... 69 شکل 3-27 دستگاه اتوآنالایزر هیتاچی .......................................................................................................... 70 شکل 3-28 مراحل Set up کردن دستگاه هیتاچی ................................................................................. 71 و 72 شکل 3-29 فرآیند انجام اندازه گیری ADA ................................................................................................. 73 نمودار 4-1 منحنی استاندارد بر اساس غلظت اینترفرون گاما و جذب نوری محلولهای استاندارد ............... 77 فهرست جداول جدول 1-1 بیماریزایی مایکوباکتریوم ها در میزبان های مختلف ..................................................................... 7 جدول 3-1 خلاصه ای از الزامات سطوح ایمنی ............................................................................................. 35 جدول 3-2 روش خواندن اسمیرهای رنگ آمیزی شده ................................................................................. 48 جدول 3-3 چگونگی خواندن و گزارش نتایج کشت ................................................................................... 58 جدول 3-4 اجزای موجود در کیت الایزا ..................................................................................................... 59 جدول 3-5 دستورالعمل ساخت محلول های استاندارد در کیت الایزا ......................................................... 61 جدول 3-6 اجزای تشکیل دهنده ی معرف 1 در کیت Diazyme® ............................................................ 67 جدول 3-7 اجزای تشکیل دهنده ی معرف 2 در کیت Diazyme® ............................................................ 68 جدول 4-1 اطلاعات فردی مربوط به بیماران ................................................................................................ 75 جدول 4-2 اطلاعات مربوط به غلظت و جذب نوری محلول های استاندارد تکنیک الایزا .......................... 76 جدول 4-3 میزان جذب نوری و غلظت IFN-γ محاسبه شده در نمونه ی مایع پلور بیماران ....................... 77 جدول 4-4 محاسبه ی میانگین و انحراف از معیار جامعه بر اساس غلظت IFN-γ ...................................... 79 جدول 4-5 مقایسه ی جامعه ی پلورزی سلی و جامعه ی مورد مطالعه ی ما از نظر غلظت IFN-γ ............ 79 جدول 4-6 مقایسه ی گروه پلورزی بدخیم و جامعه ی مورد مطالعه از نظر غلظت IFN-γ ....................... 80 جدول 4-7 مقایسه ی متوسط غلظت IFN-γ در گروه غیر سل غیر بدخیم با گروه مورد مطالعه ................. 80 جدول 4-8 میزان فعالیت ADA در مایع پلور بیماران ................................................................................... 80 جدول 4-9 مشاهده ی میانگین و انحراف از معیار فعالیت ADA در گروه مورد مطالعه .............................. 82 جدول 4-10 مقایسه متوسط فعالیت ADA عفونت های غیر توبرکلوزیسی.................................................. 82 جدول 4-11 مقایسه ی متوسط فعالیت ADA در جمعیت مورد مطالعه و گروه بدخیمی .............................. 83 جدول 4-12 مقایسه ی گوه مورد مطالعه و پلورال افیوژن سلی از لحاظ متوسط فعالیت ADA .................... 83 چکیدهسل یکی از کهن ترین بیماری های شناخته شده در انسان است که یک عامل عمده ی مرگ و میر در سراسر دنیا به شمار می رود. طبق گزارش سازمان بهداشت جهانی در سال 2012 میلادی، حدود 8/8 میلیون نفر جدید به این بیماری مبتلا شده و حدود 1/1 میلیون نفر در اثر این بیماری جان سپردند. این بیماری ناشی از یک باکتری متعلق به مجموعه ی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس [1] است که نوعاً ریه ها را درگیر می کند. معمولاً سل به 2 گروه ریوی و خارج ریوی تقسیم می شود. از آنجائیکه تشخیص سل در فضای جنب به خودی خود بسیار دشوار است و نیز با توجه به اینکه تست های روتین مثل اسمیر، کشت و PCR حساسیت و اختصاصیت کافی در تشخیص سل و پلورال افیوژن ناشی از آن ندارند، از میان انواع سل خارج ریوی این مطالعه با تمرکز بر بررسی روش های تشخیصی سریع تر و اختصاصی تر سل پلور انجام گردید و نمونه ی مایع پلور 45 بیمار که با علائم بالینی مشکوک به سل پلور از فروردین تا آبان ماه سال 1393 به آزمایشگاه های سطح شهر تهران مراجعه نموده بودند، مورد ارزیابی قرار گرفت. از میان روش هایی که امروزه به نظر می رسد بتوان از آنها جهت تشخیص سریعتر سل پلور استفاده نمود، اندازه گیری میزان فعالیت آنزیم آدنوزین دآمیناز و نیز سایتوکاین هایی نظیر اینتر فرون گاما است که از مهمترین تنظیم کننده های سیستم ایمنی به شمار می آید. بررسی های میکروبی بر روی نمونه ی مایع پلور شامل تهیه ی اسمیر و کشت انجام شد. اندازه گیری اینترفرون گاما در مایع پلور به روش الایزا انجام گردید. جهت سنجش میزان فعالیت آنزیم آدنوزین دآمیناز، سوبسترای آدنوزین تحت اثر آنزیمADA به آمونیاک و اینوزین تبدیل شده و آمونیاک حاصل با روش رنگ سنجی اندازه گیری شد. از مجموع آنالیزهای انجام شده این طور به نظر می رسد که می توان بالا بودن فعالیت کل ADA را به عنوان یک تست غربالگری در تشخیص پلورال افیوژن سلی از سایر علل پلورال افیوژن دانست؛ اما نمی تواند جایگزین روش استاندارد طلایی (کشت) باشد. از طرف دیگر تیتر اینترفرون گاما با وجود افزایشی که در سل پلور نشان می دهد، می تواند در موارد دیگری به غیر از سل مانند انواع التهاب ها به دلیل تماس بدن با آنتی ژن های باکتری افزایش یابد و لذا نمی توان به طور اختصاصی بالا بودن غلظت اینترفرون گاما را دلیل قطعی بر عفونت با مایکوباکتریوم توبرکلوزیس دانست. واژگان کلیدی: آدنوزین دآمیناز، اینترفرون گاما، مایع پلور،سل فصل اولکلیاتفصل اول- کلیات1-1 تاریخچه ی بیماری سلبیماری سل می تواند به شکل های متفاوتی ظاهر شود و حتی استخوان ها را مورد حمله قرار داده و باعث تغییر شکل در استخوان ها گردد. بافت های سخت مانند استخوان ها می توانند باکتری ها را برای هزاران سال در خود حفظ کنند، به طوری که باکتری عامل بیماری سل را می توان در اجساد انسان هایی که در بیش از 4000 سال پیش در اثر سل استخوانی مرده اند، یافت. فراوانی اسکلت های کشف شده با ظاهر استخوان های تغییر شکل یافته ی سلی در مصر قدیم، نشان می دهد که این بیماری در جمعیت آن زمان مصر شایع بوده است. همچنین کشف استخوان های تغییر شکل یافته ی مشابه، متعلق به دوران نوسنگی در مناطق مختلف در کشورهای ایتالیا، دانمارک و نیز کشورهایی در خاورمیانه نشان می دهد که توبرکلوزیس از هزاران سال پیش در سرتاسر دنیا وجود داشته است (Daniel, 2006). منشاء مایکوباکتریوم توبرکلوزیس عامل ایجاد سل، موضوع بسیاری از بررسی های اخیر بوده است و چنین استنباط می شود که باکتری های موجود در جنس مایکوباکتریوم مانند سایر اکتتینومیست ها ابتدا در خاک وجود داشته اند و سپس برخی از گونه ها خود را با زندگی در پستانداران تطبیق داده اند. احتمالاً اهلی کردن احشام که بین ده هزار تا بیست و پنج هزار سال پیش صورت گرفته است، باعث شده مایکوباکتریوم های بیماریزا از طریق دام های اهلی شده به انسان منتقل شده که در این تطابق با میزبان جدید، باکتری جدید به وجود آمده که بسیار شبیه به مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و دارای ارتباط بسیار نزدیکی با آن بوده است و این گونه تصور می شود که مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در طی یک جریان یا فرایند تکاملی از مایکوباکتریوم بوویس [2] که باعث ایجاد یک بیماری مشابه سل در احشام می گردد، به وجود آمده است. این فرضیه در حال حاضر به خاطر داده های جدید مورد تردید قرار گرفته است (Marais & Zumla, 2013). در نوشته های به ثبت رسیده در لوح های گلی آشوری ها در قرن هفتم پیش از میلاد، بیمارانی با سرفه های خونی توصیف شده اند و بقراط در قرن پنجم قبل از میلاد علائم بالینی بیماران با مرض سل (واژه ی یونانی آن Phthisis است) را به صورت سل ریوی، فساد بافت ها، ضعف و لاغری مفرط همراه با درد قفسه ی سینه و سرفه که در اغلب موارد وجود خون در خلط را به همراه دارد توصیف کرده است. فراوانی وقوع و توصیف علائم شبیه به سل تا این زمان نشان می دهد که بیماری در آن دوران شیوع فراوانی داشته است (Restrepo & Schlesinger, 2014). تصور می شود که احتمالاً بیماری سل از طریق مهاجرت چوپانان گله های گاوهای هندو-اروپایی که با گاوهای آلوده به این باسیل در تماس بوده اند، به دیگر مناطق حمل و انتقال داده شده است (Daniel, 2006; Restrepo & Schlesinger, 2014). در اواخر نیمه ی قرن نوزدهم، مرگ ومیر ناشی از سل کاهش یافت و این موضوع به طور وسیعی ناشی از رعایت اصول بهداشتی و خانه سازی بوده است. سپس با مهاجرت اروپاییان به دنیای جدید، این بیماری به امریکا نیز وارد شد؛ لیکن میزان مرگ و میر هرگز به سطح آنچه که در اروپا رسیده بود نرسید. کاهش میزان ناتوانی و مرگ ومیر ناشی از سل در خلال قرن بیستم در کشورهای پیشرفته به دلیل آموزش های بهداشت عمومی، استفاده ی گسترده از واکسن BCG تهیه شده از سویه ی ضعیف شده ی مایکوباکتریوم بوویس و همچنین گسترش و توسعه ی آنتی بیوتیک ها در دهه ی 1950 بوده است (Mandal, 2013). دوره ی آنتی بیوتیک ها در رابطه با بیماری سل توسط کشف استرپتومایسین به وسیله ی شواتز و واکسمن در دهه ی 1940 شروع شد و در درمان بیماری سل مورد استفاده قرار گرفت، که این روند با تولید آنتی بیوتیک های زیاد دیگری مثل ایزونیازید، ریفامپین و پیرازین آمید که در مقابل بیماری سل مؤثر هستند ادامه یافت، ولی نتوانست بیماری را ریشه کن کند(WHO, 2010). علاوه بر آن استفاده ی گسترده از BCG که یک واکسن سویه ی ضعیف شده ی مایکوباکتریوم بوویس بیماریزاست که توسط کالمت و گورین در دهه ی 1920 در پاریس تولید شده بود، نتوانست میزان بروز بیماری سل را در سال های اخیر کاهش دهد و امروزه موارد سل بیش از دوره ها ی قبل است. (Lienhardt, Vernon, & Raviglione, 2010; Yew, Lange, & Leung, 2011) 1-2 عامل بیماری زا - مایکوباکتری مایکوباکتری ها یا باکتری های اسیدفست [3] ، باکتری های میله ای شکل، بی حرکت و هوازی بوده که اسپور تشکیل نمی دهند. (D. Longo et al., 2011) این باکتری ها خصوصیات بیولو‍‍ژیکی ویژه ای دارند که آنها را از میکروارگانیسم های دیگر متمایز می سازد. این باکتری ها به علت داشتن مواد مومی [4]در دیواره ی سلولی خود به سهولت رنگ نمی گیرند، اما به وسیله ی فوشین داغ، از رنگ اشباع شده، به طوری که حذف رنگ به وسیله ی اسید الکل مشکل است. به همین دلیل، آنها را اسید فست یا مقاوم در برابر اسید می نامند. (D. L. Longo, 2013) مایکوباکتریوم توبرکلوزیس می‌تواند در برابر مواد ضد عفونی کننده ضعیف مقاومت کند و می‌تواند در یک شرایط خشک هفته‌ها زنده بماند. در طبیعت، باکتری تنها می‌تواند در داخل سلول یک ارگانیسم میزبان رشد کند، اما مایکوباکتریوم توبرکلوزیس می‌تواند در آزمایشگاه کشت شود. خصوصیت دیگر این گروه از باکتری ها آن است که مایکوباکتری های پاتوژن در محیط کشت سنتزی خیلی آهسته رشد می کنند و حتی عامل بیماری جذام، مایکوباکتریوم لپره [5] را تاکنون موفق نشده اند در محیط آزمایشگاهی کشت دهند. این باکتری هر 20-16 ساعت یک بار تقسیم می شود. سرعت آن در مقایسه با دیگر باکتری ها که معمولاً در کمتر از 1 ساعت تقسیم می شوند آهسته است (Gengenbacher & Kaufmann, 2012) بیش از 200 گونه از مایکوباکتریوم ها وجود دارند که در اکثر نقاط دنیا پراکنده اند و فقط تعداد کمی از آنها برای انسان و حیوانات نظیر پرندگان، خزندگان و ماهی ها بیماری زا می باشند. مایکوباکتری های پاتوژن که بیشتر از همه مورد توجه قرار دارند شامل باسیل سل نوع انسانی به نام مایکوباکتریوم توبرکلوزیس که میزبان اصلی آن انسان است و باسیل سل نوع گاوی مایکوباکتریوم بوویس که برای انسان، گاو و حیوانات دیگر بیماریزاست (Majoor, Magis-Escurra, van Ingen, Boeree, & van Soolingen, 2011). 1-2-1 مایکوباکتریوم توبرکلوزیسمایکوباکتریوم توبرکلوزیس در لامی که از نمونه های انسان تهیه شده است، به صورت باسیل های دراز، مستقیم یا کمی خمیده به طول 3 میکرون و عرض 4/0 میکرون دیده می شوند. این باکتری ها در محیط کشت به صورت اشکال فیلامنتی و کوکسی هم مشاهده می شوند. این باسیل ها فاقد اسپور، باریک و هوازی بوده و در رنگ آمیزی گرم اغلب خنثی هستند. اسید فست بودن این باکتری به طور عمده ناشی از مقدار زیاد اسیدهای مایکولیک، اسیدهای چرب دارای زنجیره ی بلند و اتصالات عرضی و لیپیدهای دیگر دیواره ی سلولی ارگانیسم می باشد. (WHO, 2013b) 1-2-2 اجزای تشکیل دهنده ی دیواره ی سلولی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس محتویات دیواره ی سلولی مایکوباکتری ها موجب افزایش حساسیت تأخیری و مقاومت در برابر عفونت می شود. به علاوه، این مواد می تواند جایگزین سلول کامل مایکوباکتری گردد. در دیواره ی سلولی مایکوباکتری، اتصال لیپید به آرابینوگالاکتان و پپتیدوگلیکان زیرین موجب نفوذپذیری بسیار کم دیواره ی سلولی می گردد و بدین ترتیب تأپیر گذاری اغلب آنتی بیوتیک ها را کاهش می دهد (شکل 1-1). (Kleinnijenhuis, Oosting, Joosten, Netea, & Van Crevel, 2011; Roy et al., 2014) شکل 1-1 ساختمان دیواره ی سلولی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس- این شکل نمایی از اجزای مهم تشکیل دهنده ی دیواره ی سلولی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس را نشان می دهد. 1-3 بیماری زاییتفاوت های بسیاری در توانایی مایکوباکتری های مختلف در ایجاد ضایعاتی در میزبان های متفاوت وجود دارد که در جدول 1-1 نشان داده شده است. انسان و خوکچه ی هندی به عفونت با مایکوباکتریوم توبرکلوزیس بسیار حساس هستند، در صورتی که پرندگان و چهارپایان به این باکتری ها مقاوم اند. قدرت بیماری زایی مایکوباکتریوم توبرکلوزیس و مایکوباکتریوم بویس در انسان یکسان است. در کشورهای پیشرفته، مایکوباکتریوم بویس به علت پاستوریزه کردن شیر بسیار کمیاب است. راه ورود دو باکتری فوق به انسان از راه راه تنفسی و گوارشی است. (Philips & Ernst, 2012) 1-3-1 فاکتور طنابی [6] در محیط کشت، سویه های بیماری زای باسیل سل معمولاً طناب های میکروسکوپی [7] را تشکیل می دهند که در آن باسیل های اسید فست به صورت زنجیرهای موازی مانند طناب کنار یکدیگر قرار دارند. وجود طناب با بیماری زایی باسیل سل همراه است. عامل طنابی که از تره هالوز 6-6-دی مایکولات تشکیل شده است موجب می شود که مایکوباکتری بیماریزا به صورت زنجیرهایی مشابه طناب تجمع یابند و آن را می توان به وسیله ی اتر از باسیل بیماریزا استخراج کرد (Welsh et al., 2013). این ماده مانع تخریب گرانول ماکروفاژها شده و در نتیجه، از فاگوسیتوز شدن مایکوباکتری ها جلوگیری می شود. این فاکتور از نقل و انتقال لوکوسیت ها جلوگیری می کند و گرانولوم های مزمنی را تولید می نماید. به همین جهت فاکتور بیماریزایی نام دارد. (Schoenen et al., 2010) جدول 1 -1 بیماری زایی مایکوباکتری ها در میزبان های مختلف چهارپایان پرندگان خوکچه هندی انسان انواع مایکوباکتری ها - - +++ +++ مایکوباکتریوم توبرکلوزیس +++ - +++ +++ مایکوباکتریوم بویس - - - +++ مایکوباکتریوم کانزاسی - +++ - + مایکوباکتریوم اویوم-اینتراسلولار - - - + مایکوباکتریوم فورتوئیتوم - - - ++ مایکوباکتریوم لپره 1-4 انتقال باسیل سل به انسانمایکو باکتریوم توبرکلوزیس غالباً از طریق قطراتی که در اثر سرفه، عطسه و یا در حین صحبت کردن توسط فرد مبتلا به عفونت سل ریوی در هوا پراکنده می شوند به دیگران منتقل می گردد. قطرات کوچک به سرعت خشک می شوند، کوچکترین قطرات (با قطر کمتر از 5 تا 10 میکرومتر) ممکن است برای چندین ساعت در هوا معلق باقی بمانند و هنگامی که استنشاق می شوند به راه های هوایی انتهایی برسند. ممکن است در هر بار سرفه کردن حدود 3000 ذره ی عفونی پراکنده شوند. طرق دیگر انتقال باسیل سل، نظیر پوست یا جفت، غیر شایع می باشند و از نظر همه گیر شناسی چندان قابل ملاحظه نیستند (D. L. Longo, 2013). از میان عوامل مهم تعیین کننده در انتقال می توان به احتمال تماس با فرد مبتلا، میزان قرابت و مدت تماس، شدت عفونت در فرد مبتلا و محیط این تماس اشاره کرد. مطالعات متعدد صورت گرفته بر روی تماس های نزدیک نشان داده است مبتلایانی که خلط آنها حاوی باسیل های اسید فست، قابل مشاهده توسط میکروسکوپ می باشد، بیشترین نقش را در گسترش عفونت ایفا می کنند (D. L. Longo, 2013). کوتاه سخن اینکه خطر اکتساب عفونت با مایکوباکتریوم توبرکلوزیس بیشتر بوسیله ی عوامل خارجی تعیین می گردد. به دلیل تأخیر مراقبت و تشخیص ، تخمین زده می شود که در مناطقی با شیوع بالا یک فرد AFB مثبت پیش از تشخیص تا 20 نفر را آلوده سازد. 1-5 روند بیماری سلسیر بیماری سل در بسیاری از موارد از یک الگوی عمومی که توسط والگرن [8] شرح داده شده است پیروی می کند، وی جزئیات پیشروی و نتیجه ی بیماری سل را به چهار مرحله تقسیم کرده است: مرحله ی اول- از 3 تا 8 هفته پس از ورود مایکوباکتریوم توبرکلوزیس توسط آئروسل های استنشاق شده به حبابچه های ریوی شروع می شود، باکتری ها توسط جریان لنفاوی به غدد لنفاوی ناحیه ای در ریه ها انتشار پیدا می کنند و کانون اولیه یا گان [9] تشکیل می گردد. در این زمان است که پاسخ به توبرکولین رخ می دهد (Behr & Waters, 2014). مرحله ی دوم- حدود 3 ماه به طول می انجامد که توسط ورود باکتری های عامل بیماری از طریق جریان خون به قسمت های دیگر ریه ها و نیز اندام های دیگر مشخص می شود، در برخی افراد در این زمان بیماری می تواند به شکل مننژیت سلی یا سل ارزنی حاد و کشنده (سل منتشر شونده) اتفاق افتد. مرحله ی سوم- در طی این مرحله تورم پرده ی جنب یا التهاب سطوح ریوی می تواند رخ دهد که 3 تا 7 ماه پایدار می ماند و سبب ایجاد درد شدید قفسه ی سینه می شود، با این حال وقوع این مرحله میتواند تا 2 سال به تأخیر بیفتد. این طور تصور می شود که به وجود آمدن این حالت به خاطر انتشار خونی و رها شدن باکتری ها درون فضای پلور و تجمع باکتریایی در قسمت تحتانی در فضای ریه می باشد. در این حالت احتمالاً باکتری های آزاد یا فراورده های آنها با جزء CD4 لنفوسیت های T حساس شده، واکنش نشان داده که این عمل سبب جذب باکتری ها و سپس ازدیاد و تکثیر آنها و آزاد ساختن سایتوتوکسین های التهابی می شود.  

 نکته مهم : هنگام انتقال متون از فایل ورد به داخل سایت بعضی از فرمول ها و اشکال (تصاویر) درج نمی شود یا به هم ریخته می شود یا به صورت کد نشان داده می شود ولی در سایت اصلی می توانید فایل اصلی را با فرمت ورد به صورت کاملا خوانا خریداری کنید: سایت مرجع پایان نامه ها (خرید و دانلود با امکان دانلود رایگان نمونه ها) : jahandoc.com   مرحله ی چهارم- در آخرین مرحله یا مرحله ی رفع کمپلکس ابتدائی [10] بیماری فاقد پیشرفت می باشد و ممکن است تا 3 سال ادامه یابد. در این مرحله توسعه ی بیماری بسیار آهسته و کند بوده و آسیب های ایجاد شده ی خارج ریوی در برخی افراد مشاهده می شود. هرچند بیشتر افرادی که به باکتری آلوده می شوند، پیشرفت بیماری را نشان نمی دهند. مشخص شده است که یک سوم افراد HIV منفی دارای عفونت هستند و از این تعداد 3 تا 5 درصد از آنها بیماری سل را در سال اول نشان می دهند و 3 تا 5 درصد از افرادی که به عامل بیماری مبتلا شده اند نیز علائم بیماری را در مراحل بعدی زندگیشان (پس از 1 سال) نشان می دهند. بهتر است این طور بیان کنیم که احتمالاً اکثر موارد بیماری سل ایجاد شده در بالغین HIV منفی به دلیل فعال شدن مجدد عفونت قبلی باشد.(Light, 2011) در ادامه به تفصیل در مورد پاسخ ایمنی بدن در مقابل عفونت با مایکوباکتریوم توبرکلوزیس توضیح داده می شود. 1-6 واکنش ایمنی نسبت به سل1-6-1 تماس و عفونت اولیه زمانی که بیماران مبتلا به سل ریوی صحبت و به ویژه سرفه یا عطسه می کنند، از قطرات حاصل از ریه ی آنان تولید آئروسل هایی می شود که هرکدام از آنها حاوی تعدادی باسیل می باشد. وقتی که قطرات آلوده وارد هوا می شوند، سریعاً خشک شده و بسیار سبک می شوند، در حالی که هنوز واجد باسیل های زنده ای هستند که در هوا معلق است و در یک فضای بسته می تواند برای مدت زمان طولانی باقی بمانند. این باسیل ها قادرند برای ساعت های متمادی در تاریکی زنده بمانند و به شدت عفونت زا هستند. (Kleinnijenhuis et al., 2011) زمانی که ذرات عفونی از طریق تنفس وارد ریه ی آنان گردد، ذرات بزرگتر در موکوس نازوفارنکس یا شاخه ی تراکئوبرونشیال رسوب کرده و توسط مژه های این ناحیه ی مخاطی پاکسازی و دفع می شوند، لیکن ذرات کوچکتر با قطری کمتر از چند میکرون می توانند به حبابچه های ریوی نفوذ کنند. هنگامی که تعداد کمی از باسیل های سل ویرولانت به حبابچه های ریوی یک فرد سالم نفوذ می کند، توسط ماکروفاژهای حبابچه ای فاگوسیته شده و در آن تکثیر می یابد. سپس ماکروفاژهای دیگر و مونوسیت ها نیز به محل جذب می شوند و در فرایند دفاع علیه عفونت مشارکت می کنند. "کانون عفونی" حاصله از سلول های التهابی، ساخته شده و به عنوان کانون اولیه [11] اطلاق می گردد. (Chakrabarti & Davies, 2006) باسیل ها وآنتی ژن هایی که توسط آنها آزاد می گردد، توسط ماکروفاژها به نزدیک ترین غده ی لنفاوی نفوذ می کند. لنفوسیت های T در درون غده ی لنفاوی، آنتی ژن های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس را شناسایی می کنند و سپس به لنفوسیت های T اختصاصی تغییر شکل می یابند و در نتیجه موجب آزاد شدن لنفوکاین ها و فعال شدن ماکروفاژهایی می شوند که رشد باسیل های فاگوسیتوز شده را مهار می کند. (Ernst, 2012; Philips & Ernst, 2012) ماکروفاژهای حبابچه ای، مونوسیت ها و سلول های دندریتی در فرآوری و ارائه ی آنتی ژن ها به لنفوسیت های T – عمدتاً سلول های T +CD4 – حیاتی هستند که نتیجه آن فعال شدن و تکثیر لنفوسیت های T +CD4 است که در دفاع میزبان علیه M .توبرکلوزیس حیاتی هستند (شکل 1-2) (Ahmad, 2010). نقص کمی و کیفی سلول های T +CD4 ، ناتوانی افراد مبتلا به عفونت با HIV را در مهار تکثیر مایکوباکتریوم توجیه می کند. لنفوسیت های +CD4 فعال شده ، می توانند به سلول های TH1 و TH2 تولیدکننده ی سایتوکین تمایز یابند. سلول های TH1 CD4+ تولید اینترفرون گاما- که یک فعال کننده ی ماکروفاژ و مونوسیت می باشد- و IL-2 می کنند. (Dorhoi, Reece, & Kaufmann, 2011; Ernst, 2012; Light, 2011) واکنش های متقابل این سیتوکین ها و تنظیم متقاطع آنها پاسخ میزبان را تعیین می کنند. اگرچه نقش سیتوکین ها در پیشبرد نابود ساختن مایکوباکتریوم داخل سلولی به تمامی روشن نشده است، IFN-γ ممکن است ترشح واسطه های نیتروژن فعال را تحریک کند و ژنهایی را که در باکتری کشی مؤثرند تنظیم نماید. اینترفرون گاما همچنین فاگوسیتوز مایکوباکتری های آزاد را افزایش می دهد. (Yurt et al., 2014) شکل 1-2 کنترل تکثیر مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در بافت ریه بوسیله ی لنفوسیت های T سپس بافت ملتهب که در کانون اولیه شکل گرفته است، توسط بافت زخم فیبری که در آن ماکروفاژهای حاوی باسیل ها، جدا شده و مرده اند، جایگزین می شود. کانون اولیه، محل نکروز کازیفیه (نکروز پنیری شده) است که اختصاصی سل محسوب می شود (شکل 1-3). این کانون حاوی 1000 تا 10000 باسیل است که معمولاً قدرت بقاء آنها کاهش یافته و به آهستگی تکثیر می یابند. برخی از باسیل ها می توانند ماه ها یا سال ها زنده بمانند که این باسیل ها با عنوان باسیل های نهفته شناخته می شوند (شکل 1-4) (Gengenbacher & Kaufmann, 2012) . شکل 1-3 تشکیل گرانولوما در پی عفونت اولیه با مایکوباکتریوم توبرکلوزیس شکل 1-4 محل ضایعه ی اولیه، ضایعات گرانولوماتوز در بافت ریه آزمایشات و تجارب صورت گرفته در حیوانات نشان دهنده ی آن است که به طور میانگین 2 تا 3 هفته پس از عفونت تجربی، ایمنی هومورال و با واسطه ی سلولی (ازدیاد حساسیت نوع تأخیری) به طور همزمان رخ می دهد. در حقیقت در شمار کمتری از بیماران ، پاسخ فعال کننده ی ماکروفاژها ضعیف است و رشد مایکوباکتریوم تنها از طریق واکنش ازدیاد حساسیت تأخیری شدید مهار می شود، که خود موجب تخریب بافتی ریه می گردد . این ضایعات تمایل دارند بزرگتر شوند و به طور پیشرونده ای موجب تخریب بافت احاطه کننده ی خود شوند. در مرکز ضایعه ، مواد پنیری شکل تبدیل به مایع می شوند. دیواره ی نایژه ها و نیز عروق خونی مورد تهاجم قرار گرفته و تخریب می شوند و حفرات شکل می گیرند (شکل 1-5). مواد پنیری مایع شده حاوی تعداد زیادی باسیل است که از طریق نایژه ها تخلیه می شوند. در داخل حفرات، باسیل های سل تکثیر می شوند و به داخل راه های هوایی گسترش یافته و از طریق حرکات بازدمی مثل سرفه یا صحبت کردن در محیط تخلیه می گردند (Houston & Macallan, 2014). در مراحل اولیه ی عفونت، معمولاً باسیل ها توسط ماکروفاژها به غدد لنفاوی موضعی انتقال می یابند و از آنجا به جریان برگشت وریدی مرکزی دسترسی پیدا می کنند، از آنجا دوباره در ریه ها کاشته می شوند و همچنین ممکن است از طریق گردش خون سیستمیک در کل بدن و فراتر از گردش خون ریوی گسترش یابند (شکل 1-6). ضایعات حاصله ممکن است سیری مانند ضایعات ریوی را پشت سر گذارند، گرچه بیشتر آنها به سوی بهبودی می روند. (Dorhoi et al., 2011; D. L. Longo, 2013) شکل 1-5 نمایش حفره ی سلی در بافت ریه ی فرد مبتلا به سل ریوی در پی واکنش ازدیاد حساسیت از نوع تأخیری در مقابل عفونت با مایکوباکتریوم توبرکلوزیس 1-6-2 ظهور کانون ثانویهقبل از اینکه واکنش ایمنی ظاهر شود، باسیل ها از کانون عفونی اولیه یا از نزدیکترین غده ی لنفاوی توسط سیستم لنفاوی وارد جریان خون شده و سپس از طریق جریان خون به درون بدن منتشر می گردند. پس از آن کانون ثانویه ی عفونت که حاوی تعداد محدودی از باسیل هاست بویژه در غدد لنفاوی، غشاهای مترشحه، مننژها، استخوان ها، کبد، کلیه ها و ریه ها تشکیل می شود، ولی به زودی پس از ایجاد یک پاسخ ایمنی، بیشتر این کانون ها، خودبخود بهبود می یابند. با این حال تعدادی از باسیل ها ممکن است در کانون های ثانویه برای ماهها یا حتی سالها به صورت نهفته باقی بمانند. (Philips & Ernst, 2012) اگرچه جداسازی ارگانیسم های کمپلکس مایکوباکتریوم توبرکلوزیس نشان دهنده ی عفونت می باشد، پزشک بایستی در موارد جداسازی مایکوباکتریوم های آتیپیک علائم بالینی بیمار را بررسی کند، به عبارت دیگر بایستی مشخص کند که باکتری جدا شده عامل عفونت است و یا تنها در موضع کلونیزه شده است. زیرا توانایی بیماریزایی این باکتری ها متفاوت است و ممکن است در یک فرد بدون ایجاد عفونت، کلونیزه شوند. شکل 1-6 نمایش کلی از آسیب زایی در عفونت اولیه و پسا اولیه با مایکوباکتریوم توبرکلوزیس 1-7 انواع سل معمولاٌ سل به 2 گروه ریوی و خارج ریوی یا هر دو تقسیم می شود. پیش از شناخت عفونت HIV ،حدود 80% موارد سل محدود به شش ها بود ، اما تا دو سوم موارد سل در مبتلایان به ایدز شامل عفونت های توأم ریوی و خارج ریوی و یا ابتلای خارج ریوی به تنهایی می باشد. مایکوباکتریوم توبرکلوزیس معمولا در ریه ها ایجاد عفونت می کند، اما در یک سوم موارد ممکن است اندام های غیراز ریه ها را نیز درگیر نماید. 1-7-1 سل ریویسل ریوى را مى‌توان به دو دسته سل اولیه و سل پس از درگیرى اولیه تقسیم نمود. اگر یک عفونت سل فعال شود، در حدود ۹۰٪ از مردم در ریه‌ها بروز می‌کند. علائم می‌تواند شامل درد قفسه سینه و سرفه‌های طولانی باشد که تولید خلط می‌کنند. در حدود ۲۵٪ از افراد هیچ علائمی ندارند (یعنی آنها «بدون علامت» باقی می‌مانند). گاهی اوقات، افراد دچار سرفه‌های خونین در مقادیر کم می‌شوند. سل می‌تواند تبدیل به یک بیماری مزمن شده و باعث زخم‌های گسترده در نرمه فوقانی ریه‌ها شود. قسمت فوقانی ریه‌ها بیشتر تحت تأثیر قرار می‌گیرند. دلیل آن به طور کامل روشن نیست. شاید قسمت فوقانی ریه‌ها به دلیل جریان هوای بهتر یا خروجی ضعیف غدد لنفاوی بیشتر تحت تأثیر قرار می‌گیرند (Philips & Ernst, 2012). 1-7-2 سل خارج ریویدر ۱۵–۲۰٪ از موارد فعال، عفونت به خارج از اندام‌های تنفسی گسترش می‌یابد که باعث بروز انواع دیگر سل می‌شود. به سلی که خارج از اندام‌های تنفسی رخ می‌دهد، «سل خارج ریوی» گفته می‌شود. سل خارج ریوی به طور معمول در افرادی که دچار نقص سیستم ایمنی هستند و کودکان رخ می‌دهد. سل خارج ریوی در بیش از ۵۰٪ از افرادی که HIV دارند دیده می‌شود (Kawkitinarong, Dumrongpiwat, & Sittipunt, 2011). مکان‌های عفونت قابل توجه خارج ریوی عبارتند از: سیستم عصبی مرکزی (در مننژیت سلی)، جنب (در سل جنبی یا پلور) و سیستم لنفاوی (در سل غدد لنفاوی گردن). از میان مکان‌های دیگر سل خارج ریوی در دستگاه ادراری تناسلی (در سل ادراری تناسلی) و در استخوان‌ها و مفاصل (در سل ستون فقرات) نیز اتفاق می‌افتد. هنگامی که این بیماری در استخوان هم گسترش می‌یابد، آن را به عنوان «سل استخوانی» نیز می‌شناسند، که نوعی از استئومیلیت (کورک استخوانی) می‌باشد. یک نوع بالقوه جدی تر و شایع سل، سل «منتشر» نام دارد، که معمولاً به عنوان سل ارزنی یا میلیاری شناخته شده است. سل ارزنی در حدود ۱۰٪ از موارد سل خارج ریوی را تشکیل می‌دهد (Chandir et al., 2010). مطالعه ی حاضر در جهت شناسایی و مقایسه ی روش های مختلف تشخیص سل پلور (سل جنبی) انجام گرفته است؛ لذا در ادامه به توصیف سل پلور و علائم بالینی حاصل از آن پرداخته شده است. 1-7-2-1 سل پلوردرگیری جنب در سل اولیه حدود 20% از موارد سل خارج ریوی را در ایالات متحده و جاهای دیگر شامل می شود. پلورال افیوژن (تراوش جنبی) جدا شده معمولاً عفونت اولیه ی اخیر را نشان می دهد و تجمع مایع در فضای جنبی نمایانگر یک پاسخ ازدیاد حساسیتی به آنتی ژن های مایکوباکتری است. بسته به گستره ی واکنش، تراوش ممکن است اندک و غیر قابل ملاحظه بوده و خود بخود بهبود یابد و یا آنقدر حجیم باشد که تولید تب ، درد پلورتیک و تنگی نفس کند (شکل 1-7). (Chakrabarti & Davies, 2006; Frank, 2013) شکل 1-7 رادیوگراف قفسه ی سینه در یک بیمار آلوده به عفونت HIV و سل جنب – تراوش جنبی قابل ملاحظه ای در سمت چپ دیده می شود. 1-7-2-2 تظاهرات بالینی ناشی از سل پلور یافته های حاصل از معاینه ی بالینی ناشی از پلورال افیوژن عبارتند از : صدای گنگ ناشی از دق کردن و یا فقدان صدای تنفسی. در تصویر قفسه ی سینه تجمع مایع در فضای جنب مشاهده می شود و تا یک سوم موارد نیز ضایعات پارانشیمی مشاهده می گردد (شکل 1-8). (Kawkitinarong et al., 2011) به منظور تعیین ماهیت مایع و تمایز آن از تظاهرات علل دیگر ، می بایست توراسننتز انجام داد. مایع به رنگ کهربایی و گهگاه خونی است؛ این مایع اگزوداست با غلظت پروتئینی بیش از 50% سرم ، غلظت گلوکز آن طبیعی یا پائین است، PH حدود 3/7 را دارا می باشد و گلبول های سفید خونی در آن قابل مشاهده اند (معمولاً µL /6000-500) (Houston & Macallan, 2014). در مراحل اولیه ی ابتلا به سل جنبی ، ممکن است نوتروفیل ها در آن بیشتر به چشم بخورند، در حالیکه در مراحل بعدی عفونت، لنفوسیت ها یافته های معمول تری هستند. سلول های مزوتلیومی عموماً یا وجود ندارند و یا یافته ای نادر می باشند. باسیل های اسید فست ، در 10-25 درصد از موارد به صورت مستقیم در گستره قابل مشاهده خواهند بود، ولی کشت ها ممکن است برای مایکوباکتریوم توبرکلوزیس در 75-25 % موارد مثبت شوند. کشت های مثبت در موارد بیماری ثانویه شایع تر است. لیزوزیم هم در تراوش جنبی وجود دارد. (Khan et al., 2013; D. L. Longo, 2013) شکل 1-8 نمایش بافت ریه، جنب و تراوش جنبی ناشی از سل 1-8 روش های تشخیصی بیماری سل [12] 1-8-1 روش میکروسکوپی-رنگ آمیزی زیل نلسنمایکوباکتریوم ها را نمی توان در گروه باکتری های گرم مثبت یا گرم منفی قرار داد. در واقع، روش رنگ آمیزی گرم در طبقه بندی آنها با ارزش نیست. بررسی میکروسکوپی باسیل ها از روش های مستقیم تشخیصی به شمار می آید که لازمه ی آن انجام رنگ آمیزی لام های تهیه شده می باشد. همانطور که پیش تر گفته شد، دیواره ی سلولی مایکوباکتریوم ها حاوی اسید مایکولیک می باشد. مایکولیک اسیدهای بلند زنجیره به خوبی با رنگ های بازی مانند کربول فوشین اتصال برقرار می نمایند و به این باکتری ها خصوصیت مقاومت به اسید می دهند که در تشخیص آن ها از باکتری های دیگر کمک کننده است. به این صورت که این باکتری ها پس از اتصال پایدار با رنگ، در مقابل عوامل رنگبر الکل ها و اسید های قوی مقاومت به خرج می دهند (اسید فست). در حالیکه سایر باکتری ها (غیر مقاوم به اسید) هنگام مجاورت با محلول اسید – الکل به آسانی رنگ خود را از دست می دهند. اسید فست بودن تحت تأثیر کلنی، محیط کشت و نور ماوراء بنفش قرار می گیرد. برای پی بردن به خاصیت مزبور و همچنین رنگ آمیزی باکتری از روش زیل نلسن استفاده می شود. در این روش، مایکوباکتری ها بر خلاف سایر باکتری ها به وسیله ی الکل اتیلیک 95 درصد و اسیدکلریدریک 3 درصد بی رنگ نمی گردند (شکل 1-9). درباره ی این رنگ آمیزی در فصل سوم به تفصیل بحث شده است. مایکوباکتری های موجود در خلط یا ترشحات بافتی را می توان پس از رنگ آمیزی با رنگ های فلوروکروم [13] مانند اورامین و رودامین [14] در زیر نور اولتراویولت به رنگ نارنجی درخشان نیز مشاهده کرد (Osman, Mus--, & Tarek, 2014). در رنگ آمیزی گرم، مایکوباکتری ها به صورت باسیل های باریک، کم رنگ، گرم مثبت و گاهی گرم خنثی می باشند. شکل 1-9 باسیل های اسید فست در نمونه ی خلط پس از رنگ آمیزی زیل نلسن در زمینه ی آبی به رنگ قرمز مشاهده می شوند. 1-8-2 کشتکشت نمونه های پاتولوژیک مشکوک به داشتن باسیل سل سخت ترین متد در تشخیص سل می باشد. اختصاصیت این تست بسیار بالاست؛ چون هر باسیل زنده بر روی محیط کشت تشکیل کلنی خواهد داد و تشخیص قطعی بیماری های مایکوباکتریومی به روش کشت امکانپذیر است. با استفاده از روش کشت امکان بررسی و ردیابی 10 تا 1000 مایکوباکتریوم زنده در هر میلی لیتر نمونه وجود دارد. تجهیزات و هزینه ی اقتصادی انجام کشت بسیار بالاتر از میکروسکوپی است. محیط کشت خوب بایستی امکان رشد سریع و زیاد مایکوباکتریوم ها را فراهم نموده و توانایی بررسی مورفولوژی کلنی ها و تولید پیگمان را داشته باشد، رشد باکتری های مزاحم را مهار کند و مقرون به صرفه باشد (Essawy, Saeed, & Fouad, 2014). 1-8-2-1 محیط کشت لوون اشتاین جنسن [15] محیط لوون اشتاین جنسن در ابتدا توسط لوون اشتاین ساخته شد و حاوی رنگ های قرمز کونگو و مالاشیت گرین [16] بود. بعدها آقای جنسن محیط لوون اشتاین را تغییر داد؛ به این صورت که محتویات سیترات و فسفات را تغییر داد و رنگ قرمز کونگو را حذف نمود و غلظت مالاشیت گرین را افزایش داد.این محیط کشت حاوی مواد مختلفی مانند نمک، گلیسرول و مواد آلی (برای مثال تخم مرغ تازه یا زرده ی تخم مرغ، آرد سیب زمینی و اجزای دیگر) می باشد. گلیسرول از یخ زدگی (ایجاد کریستال های یخ) که باعث آسیب به باسیل ها می شود جلوگیری می کند. گلیسرول و سوسپانسیون تخم مرغ، همچنین اسیدهای چرب و پروتئین مورد نیاز برای متابولیسم مایکوباکتری را فراهم می آورد. پتاسیم فسفات و منیزیم سولفات باعث ارتقاء رشد میکروارگانیسم شده و بعنوان بافر عمل می کند. مالاشیت گرین هم به عنوان یک جلوگیری کننده از رشد سایر آلوده کننده ها و هم به عنوان یک نشانگر عمل می نماید. به این صورت که تشکیل رنگ آبی نشانه ی کاهش در pH توسط آلوده کننده های گرم مثبت مانند استرپتوکوک ها بوده و تشکیل رنگ زرد نشانه ی قلیایی شدن محیط توسط باسیل های گرم منفی می باشد. (شکل 1-10). در این محیط کشت، حتی تعداد بسیار کم باسیل در نمونه های بیمار قادر به رشد و تکثیر در مدت 3 تا 6 هفته می باشد. در مطالعه ی حاضر کشت نمونه ها بر روی این محیط انجام گردید که در فصل سوم به طور مفصلی به نحوه ی ساخت آن و انجام کشت مایکوباکتریوم توبرکلوزیس پرداخته شده است. شکل 1-10 محیط کشت لوون اشتاین جنسن که به حالت مورب در لوله منعقد شده است. پایه ی این محیط کشت، تخم مرغ و رنگ مالاشیت گرین است. 1-8-2-2 خصوصیات رشدمایکوباکتری ها، هوازی اجباری بوده و انرژی مورد نیاز خود را از اکسیداسیون مواد کربن دار ساده به دست می آورند. افزودن گازکربنیک به محیط کشت موجب تقویت رشد باکتریها می گردد. زمان رشد این باسیل ها خیلی آهسته تر از سایر باکتری ها بوده، به طوری که زمان تقسیم سلولی آنها حدود 18 ساعت یا بیشتر است. کلنی باکتری های این گروه که سریع ترین رشد را دارند پس از 10 الی 14روز ظاهر شده و کلنی آنهایی که به کندی رشد می کنند، بعد از 6 الی 8 هفته مشاهده می شوند. (Roberts, Neville, Berrisford, Antunes, & Ali, 2010; WHO, 2013b) باسیل سل در محیط کشت غیر غنی رشد نمی کند. افزودن کمی گلیسرول به محیط کشت موجب رشد سریع تر سویه ی انسانی می شود، اما بر سویه ی گاوی چنین اثری نداشته و حتی ممکن است از رشد آن ها جلوگیری کند. پیرووات سدیم [17] موجب افزایش رشد سویه ی گاوی باسیل سل می شود و نیز دارای اثر مشابهی بر روی آن گروه از سویه ی گاوی و انسانی است که در اثر شیمیوتراپی آنقدر ضعیف شده اند که بر روی محیط کشت استاندارد خیلی کم رشد می کنند. کلنی های مجزای انسانی به صورت برآمده و به شکل نامنظمی با سطحی خشک، چروکیده و چسبنده رشد می کنند. رنگ آنها ابتدا سفید کرم بوده و کم کم به رنگ زرد تبدیل می شوند (شکل 1-11). شکل 1-11 کلنی های مایکوباکتریوم توبرکلوزیس بر روی محیط کشت لوون اشتاین پس از گذشت 6 هفته از زمان کشت در دمای 37 درجه ی سانتیگراد 1-9 تشخیص سل پلوربیماری که دارای علائم بالینی سل پلور مانند تب، تنگی نفس و درد قفسه ی سینه باشد و در فضای پلور تجمع مایع دیده شده و ترشحات جنبی حاوی تعداد لنفوسیت بالا باشد، مشکوک به سل پلور تلقی می گردد. نمونه برداری سوزنی از پرده ی جنب اغلب جهت تشخیص لازم است و در آن گرانولوم مشاهده می شود و یا تا 80 درصد موارد کشت تهیه شده از آن مثبت می باشد. این شکل از سل جنبی به خوبی به درمان داروئی جواب می دهد و ممکن است به صورت خود بخود بهبود یابد. ممکن است مصرف همزمان گلوکوکورتیکوئید، طول مدت تب و یا درد قفسه ی سینه را کم کند، اما فایده ی آن ثابت نشده است. در صورتی که بیمار مبتلا به سل پلور درمان نشود، در طول 3 سال آینده ممکن است به سل ریوی مبتلا گردد (Pickering, Sarefuji, Ahmed, Breen, & Milburn, 2013). 1-9-1 سنجش اینترفرون گامااینترفرونها پروتئینهای طبیعی هستند که به وسیله سلولهای سیستم ایمنی مهره داران تولید می شود و مسئولیت آنها مبارزه با عوامل خارجی از قبیل ویروسها ، انگلها و تومورها می باشد. اینترفرونها به گروه بزرگی از گلیکوپروتئینها تعلق دارند که سایتوکین نام دارند. اینترفرونها بوسیله انواع گوناگونی از سلولها تولید می شوند که این سلولها به حضور RNA دو رشته ای واکنش نشان می دهند (کلید شناسایی آلودگی ویروسی) (Devlin, 2011). اینترفرون گاما سایتوکاین اصلی فعال کننده ماکروفاژهاست و اعمال مهمی را هم در ایمنی ذاتی و هم ایمنی اکتسابی انجام می دهد این سایتوکاین معرف زیر مجموعه TH1 (لنفوسیت T کمک کننده ) است. اینترفرون گاما را اینترفرون ایمن یا اینترفرون نوع II نیز می نامند. تا حدودی فعالیت غیر ویروسی دارد ولی از این لحاظ چندان قوی نیست و بیشتر به عنوان سایتوکاین اجرایی پاسخ ایمنی عمل می کند. پلورزی سلی در نتیجه واکنش ازدیاد حساسیت تاخیری به آنتی ژن های مایکوباکتریال ایجاد می شود. تاثیرات سیتو توکسیک مایکوباکتریال ممکن است شکلی از این واکنش ها باشد. (Sester et al., 2011) در غالب بیماران بررسی میکروبیولوژیک مستقیم مایع پلور شامل پاسخ قطعی به عدم وجود عفونت مایکوباکتریوم توبرکلوزیس نیست، کشت مایع پلوربه چندین هفته زمان نیاز دارد و بیوپسی سوزنی پلور و توراکوسکوپی هر دو اقدامات تهاجمی محسوب می شوند. در سالهای اخیر، مارکرهای بیولوژیک متعددی برای افزایش قدرت تشخیص پلورزی سلی به کار برده شده اند که اینترفرون گاما از آن جمله است(Cattamanchi et al., 2011). اینترفرون گاما یکی از مهمترین تنظیم کننده های سیستم ایمنی است که هم اثرات ضد ویروسی وهم اثرات سیوتوکسیک دارد. این لنفوکین همانطور که گفته شد توسط سلولهای ایمنی در پاسخ به تحریکات آنتی ژنیک وایمونولوژیک ساخته می شود. (Marie et al., 2013; Mazurek et al., 2010) تمام سلولهای T CD4+و سلولهای 1 CD4+ Th ، می توانند اینترفرون گاما تولید کنند . اینترفرون گاما موجب افزایش فعالیت فاگوستیک ماکروفاژها علیه مایکوباکتریوم توبرکولوزیس شده و درسطح آن در جریان پلورزی سلی و در نتیجه افزایش تولید در موضع، افزایش می یابد (F. Liu et al., 2014; Titarenko et al., 2010). به دلیل اینکه لنفوسیت تولید کننده اینترفرون گاما به فضای پلور مهاجرت می کند و در نتیجه آن پاسخ سیستمیک به سلولهای فوق کاهش می یابد. (Dorhoi et al., 2011; Zwerling et al., 2011) مطالعات متعددی نشان داده اند که سطح اینترفرون گاما چه در ریزش جنبی و چه در سرم در جریان پلورزی سلی به طور چشمگیری نسبت به بدخیمی و سایر علل پلورزی افزایش می یابد و اینکه این افزایش در ریزش جنبی بسیار چشمگیر تر از سرم است. (Klimiuk & Krenke, 2011; Zwerling et al., 2011) به نظر می رسد که اندازه گیری این مارکر بیولوژیکی می تواند یک راه غیر تهاجمی تر و حساس تر در تشخیص پلورزی سلی باشد و بتوان از آن به عنوان جایگزین روشهای تهاجمی معمول سود برد (Aoe, Hiraki, & Murakami, 2004) که در این مطالعه نیز به بررسی ارزش تشخیصی تیتر آن در سل پلور پرداخته شده است. به منظور ارزیابی و اندازه گیری غلظت این سایتوکاین از روش ELISA بهره جستیم و بنابراین در ادامه ی این نوشتار به معرفی مختصری از این تکنیک و اجزای لازم برای آن می پردازیم. 1-9-1-1 تکنیک الایزا [18] پایه ی اساسی آزمون الایزا براساس واکنش آنتی‌بادی با آنتی‌ژن می‌باشد. در آزمون‌های الایزا یک آنتی‌بادی اختصاصی با یک آنتی‌ژن مشخص واکنش داده و سپس با استفاده از یک آنتی‌بادی اتصال یافته با یک آنزیم بعنوان سیستم نشانگر، آزمون ادامه یافته و درنهایت با افزودن سوبسترای آنزیم و تبدیل سوبسترا به محصول که یک ماده رنگی می‌باشد آزمون الایزا به پایان می‌رسد. طول موج رنگ بدست آمده که نشانگر حضور یک آنتی‌بادی (و یا آنتی‌ژن) و نیز غلظت آن می‌باشد توسط یک دستگاه اسپکتروفتومتر قرائت شده و ثبت می‌گردد (Devlin, 2011). 1-9-1-2 وسایل و تجهیزات مورد نیاز در روش الایزاالف: کیت الایزا شامل:1- یک یا دو عدد پلیت ۹۶ خانه‌ای که در ۱۲ ستون هشت خانه‌ای قرار گرفته‌اند. هر یک ازخانه‌ها را چاهک[19] و هر ستون هشت خانه‌ای را یک استریپ[20] گویند. جنس چاهک‌ها از پلی‌ استیرن، پلی‌ وینیل کلراید و یا پلی‌ پروپیلن بوده، عمقی حدود 1 سانتی متر داشته و به اشکال ته صاف و یا ته گود می‌باشند، که بطور ایده آل چاهک‌های ته صاف برای قرائت اسپکتروفتومتری در سنجش‌هایی که در آنها پیشرفت رنگ وجود دارد، پیشنهاد می‌شود. 2- ویال‌های استاندارد، کنترل منفی و مثبت، که با توجه به نوع کیت می‌توانند بصورت محلول یا لیوفیلیزه باشند.3- رقیق‌کننده نمونه [21] که مزیت آن اینست که با توجه به رقیق سازی نمونه، اثر هوک را تا حدود زیادی خنثی می‌نماید.4- کونژوگه نشاندار شده با آنزیم که از مهم‌ترین آنزیم‌های مورد استفاده در الایزا می‌توان از پراکسیداز ترب کوهی یا HRP ، آلکالن فسفاتاز و پنی سیلیناز نام برد که عمدتا از پراکسیداز استفاده شده و از آلکالن فسفاتاز به علت گرانی، در کارهای تحقیقاتی استفاده می‌شود. بایستی متذکر شد که آنزیم مورد استفاده برای نشاندارسازی، نقش مهمی در تعیین نوع سوبسترا و نیز نوع محلول متوقف‌کننده دارد.5- محلول شستشو که متشکل از بافر فسفات سالین [22]، تواین ۲۰ و تایمرسال می‌باشد. باید توجه داشت که هر چند PBS با تنظیم قدرت یونی و pH مناسب، اتصال غیر اختصاصی به جدار چاهک را به حداقل می‌رساند؛ با این حال برای افزایش دقت و نیز کاهش اتصالات غیر اختصاصی، از مقدار کمی پروتئین ودترژان یعنی تواین ۲۰ استفاده می‌شود. همچنین از آنجائی که محیط‌های بافری غالبا برای رشد میکروارگانیسم‌ها بسیار مناسب می‌باشند، لذا از ترکیبات نگهدارنده نظیر تایمرسال و سدیم آزید استفاده می‌شود؛ که البته با توجه به اینکه سدیم آزید مهار کننده آنزیم پراکسیداز می‌باشد، از این رو از تایمرسال استفاده می‌گردد.6- محلول سوبسترا- کروموژن که می‌تواند هم بصورت منفک از یکدیگر و یا بصورت ترکیبی باشد.لازم بذکر است که در واکنش‌های آنزیمی، سوبسترا بر اساس حلالیت، می‌تواند محلول یا غیر محلول باشد؛ که در سنجش الایزا بایستی سوبسترا محلول باشد. زیرا اگر غیر محلول باشد، نمیتوان محصول را با دستگاه خوانشگر الایزا یا الایزا ریدر قرائت نمود و توضیحا اینکه، سوبسترای غیر محلول در روش دات الایزا [23] و بلاتینگ کاربرد دارد. در مورد نوع سوبسترا نیز بایستی در نظر داشت، نوع سوبسترا بستگی به کونژوگه آنزیمی داشته و لذا اگر کونژوگه آنزیمی HRP باشد، سوبسترا می‌تواند تترامتیل بنزیدین (TMB) و یا ارتوفنل دی آمین (OPD) بوده و رنگ حاصل از واکنش آنزیمی آبی خواهد شد. اما اگر کونژوگه آنزیمی ALP باشد، سوبسترا پارانیتروفنل (PNP) بوده و رنگ حاصل از واکنش نیز، زرد خواهد شد.7- محلول متوقف‌ کننده یا بلوکر[24] که با توجه به نوع کونژوگه آنزیمی، می‌تواند اسیدی یا قلیایی باشد. بدین ترتیب که اگر کونژوگه آنزیمی HRP باشد، برای توقف واکنش بایستی از محلول‌های اسیدی نظیر اسید کلریدریک و یا اسید سولفوریک استفاده نمود. ولی اگر کونژوگه ALP باشد، بایستی از محلول‌های قلیایی نظیر NaOH استفاده کرد. لازم بذکر است که در اثر توقف واکنش توسط متوقف‌ کننده اسیدی، رنگ آبی تبدیل به زرد شده، در حالیکه تغییر رنگ حاصل از کاربرد متوقف‌ کننده قلیایی، بصورت تبدیل رنگ زرد به قهوه‌ای خواهد بود. ب: دستگاه خوانشگر الایزا [25] : دستگاه الایزا ریدر که در نهایی‌ترین مرحله آزمایش الایزا مورد استفاده قرار گرفته و جزء لاینفک تکنیک الایزا می‌باشد، در واقع شبیه اسپکتروفتومتر بوده، با این تفاوت که نوع کووت، مسیر خوانش و تعداد فیلترها تغییر نموده است. بدین ترتیب که بجای کووت، از چاهک استفاده شده و مسیر خوانش آن نیز بر خلاف تکنیک‌های فتومتری، بصورت عمودی می‌باشد. همچنین با توجه به اینکه در تکنیک الایزا از آنزیم‌ها و سوبستراهای مشخصی استفاده می‌شود، از فیلترهای محدودی استفاده شده است (Thomas, 2011) 1-9-1-3 روش الایزا ی ساندویچ [26] در روش الایزای ساندویچی، مولکول اندازه گیری شده در واقع بین دو مولکول مختلف آنتی بادی قرار می گیرد (ساندویچ می شود). در فصل سوم مفصلاً در این باره جهت اندازه گیری اینترفرون گاما و اساس این روش بحث خواهد شد (شکل 1-12) (Devlin, 2011). شکل 1-12 تصویری شماتیک از اساس تست الایزای ساندویچ- پروتئین هدف بین دو آنتی بادی حبس می شود. 1-9-2 آنزیم آدنوزین دی آمیناز [27] آدنوزین دآمیناز (ADA; EC 3.5.4.4) یکی از آنزیم های هیدرولاز است که با استفاده از یک مولکول آب باعث حذف آمونیاک از آدنوزین و دئوکسی آدنوزین شده و آنها را به ترتیب به اینوزین و دئوکسی اینوزین دآمینه می کند (شکل 1-13). ADA همچنین یک آنزیم ضروری برای مسیر کاتابولیکی نوکلئوتیدهای پورینی می باشد . شکل 1-13 آنزیم آدنوزین دآمیناز که با استفاده از یک مولکول آب، آدنوزین را به اینوزین دآمینه می کند. آدنوزین د آمیناز آنزیمی است که فعالیت آن در زمان عفونت با مایکوباکتریوم توبرکلوزیس افزایش می یابد؛ دلیل این امر تحریک لنفوسیت های T توسط آنتی ژن های مایکوباکتری است (Kelam et al., 2013). 1-9-2-1 ویژگی های آدنوزین دآمینازآدنوزین دآمیناز در همه ی انواع سلول ها وجود دارد. اگرچه مقدار این آنزیم به طور گسترده ای میان بافت های مختلف بدن تفاوت دارد. بالاترین میزان ADA در انسان در بافت های لنفاوی یافت شده است. ADA در تکثیر و تمایز لنفوسیت ها به خصوص لنفوسیت های T نقش دارد. این آنزیم همچنین در بالغ شدن مونوسیت ها و تغییر شکل دادن آنها به ماکروفاژها عمل می کند. ADA یک شاخص مهم برای فعالیت سیستم ایمنی است. برای مثال کمبود آن در انسان، در ابتدا به صورت لنفوپنیا [28] (کاهش تعداد لنفوسیت ها در خون) و نقص شدید سیستم ایمنی آشکار می شود که در طی آن لنفوسیت های B و T تکامل نیافته و عمل طبیعی خود را انجام نمی دهند (Banales et al., 1999). ژن ADA انسان بر روی بازوی بلند کروموزوم 20 قرار دارد و طول تقریبی آن kb 32 می باشد. همانگونه که ذکر شد، روش های مختلفی برای تشخیص سل وجود دارد از جمله روش میکروسکوپی، کشت و PCR، اما این روش ها حساسیت و اختصاصیت کافی را فراهم نمی آورند. مطالعات گوناگونی حساسیت و اختصاصیت بالای اندازه گیری ADA را در تشخیص سریع تر سل خارج ریوی مانند سل پلور تأیید کرده اند (Gorguner, Cerci, & Gorguner, 2000). سنجش میزان فعالیت ADA ممکن است بتواند برای تشخیص زود هنگام سل به خصوص در موارد بیماران اسمیر منفی به کار برده شود. (Khow-Ean, Booraphun, Aekphachaisawat, & Sawanyawisuth, 2013) بنابراین در مطالعه ی پیش رو سعی بر آن داریم که با بررسی میزان فعالیت این آنزیم در نمونه ی مایع پلور بیماران مبتلا به پلورال افیوژن، حسایت آن را در تشخیص سریعتر سل پلور با روش های میکروبی مقایسه نماییم. 1-9-2-2 متابولیسم آدنوزین دآمینازدر سرم انسان 3 ایزوآنزیم ADA وجود دارد: ایزوآنزیم ADA1 با وزن مولکولی 35 دالتون و در ترکیب غیر آنزیمی، دو مولکول ADA1 با پروتئین دیگری به نام پروتئین ترکیب شونده [29] ایجاد ایزوآنزیم ADA1+CP به وزن مولکولی 280 دالتون را می کند. ایزوآنزیم ADA2 نیز به وزن مولکولی 100 دالتون در سرم انسان وجود دارد. ایزوآنزیم ADA2 نه تنها در خواص سینتیکی بلکه در خواص ایمونوشیمیایی نیز با ایزوآنزیم های ADA1 و ADA1+CP تفاوت دارد. ADA1 در بیشتر بافت های بدن یافت می شود، در حالیکه ADA2 فقط در ماکروفاژها و مونوسیت ها وجود دارد. ADA2 بخش بزرگی از فعالیت کل ADA را در سرم افراد سالم شامل می شود (Carstens, Burgess, Maritz, & Taljaard, 1998). به نظر می رسد در مواقع ابتلا به بیماری های عفونی که توسط میکروارگانیسم های آلوده کننده ی ماکروفاژها ایجاد می شوند، میزان ADA در مایعات بیولوژیکی بدن افزایش می یابد . در حقیقت فعالیت این آنزیم در بیماری هایی که پاسخ سیستم ایمنی سلولی را برانگیزد، افزایش می یابد (El Jahiri, Chellak, Garcia, Ceppa, & Burnat, 2006; Y. C. Liu et al., 2011). از این رو بر آن شدیم تا با سنجش این مارکر بیوشیمیایی گامی به سوی تشخیص سریعتر و با حساسیت بیشتر سل پلور برداریم تا از این طریق استفاده از روش های تشخیصی تهاجمی مانند بیوپسی به حداقل رسانده شوند. 1-9-2-3 سنجش فعالیت آدنوزین دآمیناز ADA کل با تکنیک ها مختلفی اندازه گیری می شود که ِاین روش ها به طور عمده به 2 گروه تقسیم بندی می شوند: 1-روش Giusti 2-روش غیرGiusti (Khow-Ean et al., 2013) روش اول در سال 1974 توسط Giusti & Galanti شرح داده شد. در این تکنیک اسپکتروفوتومتری برای سنجش میزان کاهش جذب نور ناشی از تبدیل NADPH به NADP که محصول تأثیر ADA بر آدنوزین است به کار می رود. (Khurshid, Shore, Saleem, Naz, & Zameer, 2009) کیت تجاری Diazyme® که محصول کشور آمریکاست، یکی از روش های بهینه شده ی Giusti است که در مطالعه ی حاضر نیز جهت سنجش فعالیت آنزیم آدنوزین دآمیناز از آن استفاده گردید. در این باره مفصلاً در فصل سوم بحث شده است. 1-10 هدف از انجام مطالعهبا توجه به همه ی این عوامل، هدف از انجام این مطالعه بررسی ارزش تشخیصی فاکتورهای بیوشیمیایی و مقایسه ی آنها با روش های میکروبی (اسمیر و کشت) در تشخیص سل پلور می باشد. از آنجا که تشخیص سل پلور با تکیه بر روش های میکروبی و مشاهده ی میکروسکوپی به خودی خود به دلیل تعداد کم باسیل در مایع پلور بسیار دشوار است و نیز با توجه به ضرورت شروع درمان در بیماران بدحال، بر آن شدیم تا ارزش تشخیصی روش های بیوشیمیایی (اندازه گیری فعالیت آدنوزین دآمیناز و سنجش تیتر اینترفرون گاما) را در تشخیص سریعتر سل پلور در مقایسه با روش های میکروبی (اسمیر و کشت) بررسی کنیم تا از این طریق هم از روش های تهاجمی مثل بیوپسی پلور بتوان حتی الامکان دوری جست و هم تشخیص موارد منفی کاذب را تا حد امکان کاهش داد.