(3-3) در این رابطه N مجموع تعداد یاختههای قرمز شمارش شده در یک میلیمتر مکعب، n مجموع تعداد یاختههای قرمز شمارش شده در 5 مربع کوچک، S مساحت 5 مربع (یک پنچم مترمربع)، h ارتفاع هر مربع (1/0 میلیمتر) و d رقت خون در محلول رقیق کننده (یک دویستم) را نشان میدهد [4]. 3-4-4- شمارش گلبولهای سفید به دلیل تراکم کمتر سلولهای سفید خون (WBC)[70] نسبت به یاختههای قرمز، رقیق سازی با رقت کمتری صورت میگیرد. به این منظور از پیپت ملانژور سفید استفاده میشود. برای استفاده از این نوع پیپت، تا درجه 5/0 آن از خون و بقیه حجم لوله تا درجه 11 از محلول رقیق کننده ریس پر میشود (رقت یک بیستم). سپس همانند روش توضیح داده شده، سه تا چهار قطره مایع درون پیپت را تخلیه شد تا در فاصله بین آن دو جریان یابد و حجره لام را پرکند. لام در زیر میکروسکوپ قرار گرفت و یاختههای سفید موجود در چهار مربع کوچک که در چهار گوشه مربع بزرگ قرار دارند با لنز 20 شمارش شد (شکل3-3). برای محاسبه تعداد گلبولهای قرمز در هر میلیمتر مکعب خون با رقت یک دویستم از رابطه ذیل استفاده شد: (3-4) (3-5) در این رابطه N مجموع یاختههای سفید شمارش شده در یک میلیمتر مکعب، n مجموع تعداد یاختههای سفید شمارش شده در چهار4 مربع، S مساحت چهار مربع (چهار میلیمترمربع)، h ارتفاع هر مربع (1/0 میلیمتر) و d رقت خون در محلول رقیق کننده (یک بیستم) را نشان میدهد [4]. شکل 3-5) لام هماسیتومتر [4]. 3-4-5- شمارش افتراقی گلبولهای سفید تهیه گسترش خونی به روش دولامی انجام گرفت. در این روش یک لام به عنوان گسترش دهنده و لام دیگر که قطره خون روی آن قرار میگیرد، لام گسترش نام دارد. پس از ایجاد گسترش خونی، جهت جلوگیری از تغییرشکل یاختهها، تاثیر میکرواورگانیسمها و کاهش کیفیت، لام گسترش بلافاصله با متانول 95% تثبیت و سپس خشک میگردد. سپس به مدت 10-30 دقیقه با محلول گیمسا رنگآمیزی و با آب شستشو و خشک میشود. این محلول با داشتن اجزاء اسیدی و بازی، قسمتهای مختلف هر نوع سلول را به رنگ مشخصی رنگامیزی میکند و به این صورت سلولها قابل تشخیص و شمارش میگردند. برای تهیه محلول گیمسا ابتدا 1 گرم پودر گیمسا با 50 میلیلیتر گلیسرول همراه با یک هم زن مغناطیسی به مدت 1 ساعت در 60 درجه سانتی گراد حرارت داده شد. بعد از سرد شدن این ترکیب، 50 میلیلیتر متانول به آن اضافه و با کاغذ صافی فیلتر شد. این استوک با استفاده از آب شهری تا 10% رقیق شد و برای رنگ آمیزی گسترشها مورد استفاده قرار گرفت. درهرگسترش تعداد 100 عددگلبول سفید به صورت تصادفی شمارش و درصد فراوانی آنها محاسبه شد [19]. 3-4-6- شاخصهای ثانویه خونشناسی شاخصهای ثانویه خونشناسی برای توصیف اندازه سلولها و میزان هموگلوبین آنها بهکار میرود [4]. الف- حجم متوسط گویچه قرمز (MCV) این شاخص حجم متوسط هر یاخته قرمز خون را نشان میدهد. این شاخص بر حسب فمتولیتر محاسبه میشود. هر فمتولیتر برابر یک میکرومتر مکعب است. (3-6) در این رابطه، HCT میزان هماتوکریت و RBC تعداد یاختههای قرمز خون (بر حسب میلیون در میلیمتر مکعب) را نشان میدهد [4]. ب- میانگین غلظت هموگلوبین ذرهای (MCHC) این شاخص غلظت هموگلوبین در توده یاختههای قرمز را بر حسب درصد نشان میدهد. (3-7) در این رابطه، Hb میزان هموگلوبین (بر حسب گرم در دسیلیتر) و HCT میزان هماتوکریت را نشان میدهد [4]. ج- میانگین هموگلوبین ذرهای (MCH)این شاخص متوسط هموگلوبین در یک یاخته قرمزخون را بر حسب پیکوگرم نشان میدهد. (8-3) در این رابطه، Hb میزان هموگلوبین (بر حسب گرم در دسیلیتر) و RBC(بر حسب میلیون در میلیمتر مکعب) را نشان میدهد [4]. 3-5- تعیین سن برای تعیین سن از روش‌ آناتومیکی (فلس) استفاده شد. اساس کار در این روش تغییرات دوره‌ای است که در رشد سالانه ماهی روی می‌دهد.در این بررسی سن ماهیان با استفاده از بررسی دوایر سنی موجود روی فلس های برداشت شده از ناحیه بین خط جانبی و جلو باله پشتی انجام شد. رشد فلس متناسب با رشد ماهی است. همزمان با رشد فلس، حلقههای رشد سالیانه در حاشیه فلس تشکیل می شود. حلقه های رشد، یک الگوی متحدالمرکز است که مرتبط با شرایط محیطی و رشد در طی یک سال تشکیل می شود. به کمک این حلقه ها می توان سن ماهی را تعیین کرد [88]. برای زایل نمودن مواد لزج موکوسی روی فلس، شستشوی آن با آب گرم و محلول های تمیز کننده مانند مایع ظرفشویی و سپس آب مقطر انجام شد. فلس‌های آماده شده به کمک میکروسکوپ مطالعه گردید. 3-6- محاسبه شاخص توسعه گنادی (GSI) پس از تعیین جنسیت، گنادها به طور کامل خارج و برای محاسبه GSI با دقت 01/0 گرم وزن گردید. این شاخص به صورت زیر محاسبه می گردد [17]: (3-9)در این رابطه برابر با وزن گناد و برابر با وزن بدن ماهی است. 3-7- تهیه بافت گناد در این مطالعه، بخش میانی گناد تعداد 5 قطعه ماهی ماده و 5 قطعه ماهی نر از هر ایستگاه بهطور تصادفی انتخاب و به منظور انجام مطالعات بافت شناسی در فرمالین 10% قرار داده شد. سپس نمونه ها از مراحل آبگیری از طریق الکل با درجات مختلف، شفاف سازی با استفاده از گزیلول، پارافینه کردن، قالب‌گیری، برش و رنگ‌آمیزی به روش استاندارد هماتوکسیلین-ائوزین عبورداده شد. پس از رنگآمیزی با استفاده از میکروسکوپ نوری مرحله توسعه گنادی در جنس نر و ماده مورد شناسایی قرار گرفت [71].3-8- آمادهسازی نمونهها جهت مطالعات مولکولی و اندازهگیری بیان ژن ویتلوژنین بررسی های مولکولی شامل توالییابی ژن کدکننده ویتلوژنین و بررسی بیان آن، در طی دوره فرصت مطالعاتی تحت نظر پروفسور گنزالو مارتینز-ردریگز[71] در مرکز علوم دریایی اندلوسیا[72]، کادیز[73]، اسپانیا اجرا گردید. در تمام پروتوکلها شامل کیتهای تجاری مورد استفاده، دستورالعمل شرکت سازنده دنبال شد. تمام آغازگرها از شرکت اینتگریتد DNA تکنولوژیز[74] (کشور بلژیک) خریداری شد. توالییابیها با روش Dideoxy و توسط شرکت بیوتکنولوژی کمپانی (بیواری)[75] انجام گردید. 3-8-1- نمونهبرداری و تیمار در این مطالعه حدود 30 میلیگرم از کبد تعداد 5 قطعه ماهی ماده و 5 قطعه ماهی نر از هر ایستگاه به منظور انجام مطالعات مولکولی در تیوبهای 5 میلیلیتری حاوی محلول محافظتکننده از RNA[76] (ساخت شرکت فیت بیوتکنولوژی[77]) قرار داده شد و برای استخراج RNA کل در دمای C°20- قرار گرفت. از آنجاییکه برای اندازهگیری میزان بیان هر ژن داشتن آغازگرهای اختصاصی در همان گونه الزامی است و توالی ژن ویتلوژنین و بتااکتین عروسماهی زایندهرود تاکنون در بانک جهانی ژن به ثبت نرسیده است، لازم بود توالییابی و همسانهسازی[78] این دو ژن برای اولین بار در این گونه صورت پذیرد. از سوی دیگر با وجود ثبات نسبی ژن ویتلوژنین در بین ماهیان، به دلیل وجود ایزوفرمهای متعدد این ژن، به منظور جلوگیری از خطا در زمان اندازهگیری بیان ژن و ایجاد محصولات جانبی در واکنشهای زنجیرهای پلیمراز (PCR)[79]، توالییابی کامل این دو ژن انجام گردید و سپس آغازگرهای مناسب برای انجام Real-time PCR از روی آن طراحی شد. با توجه به اینکه نمونهبرداری در زمان مورد انتظار برای بالا بودن بیان ژن ویتلوژنین صورت نگرفته بود، گروهی از ماهیان پس از صید به مدت 24 ساعت تحت تیمار 2000 نانوگرم 17بتا-استرادیول/ لیتر قرار گرفتند تا بیان این ژن به میزان کافی برای ساخت cDNA اختصاصی افزایش یابد [29]. کبد آنها به تفکیک جنسیت در تیوبهای حاوی محلول محافظتکننده از RNA و تا زمان استخراج RNA در دمای C°20- قرار گرفت. 3-8-2- استخراج و تعیین کمیت و کیفیت RNA در تمام نمونهها، RNA با استفاده از کیت نوکلئواسپین RNA II[80] ساخت شرکت مچری-ناجل[81] استخراج شد و هضم DNA بر روی ستون و با استفاده از آنزیم DNase فاقدRNase موجود در کیت انجام گرفت. کمیت RNA به روش اسپکتروفتومتری در طول موج 250 نانومتر توسط دستگاه بیوفتومترپلاس[82] ساخت شرکت اپندورف[83] مورد بررسی قرار گرفت. به علاوه کیفیت تقریبی آن از طریق دو شاخص که از رابطه میزان جذب نوری در 260 نانومتر/ 280 نانومتر و همچنین 260 نانومتر/ 230 نانومتر بهدست میآید و مستقیما توسط دستگاه محاسبه میشود، مورد ارزیابی قرار گرفت. حداکثر جذب نوری توسط RNA در 260 نانومتر صورت میگیرد. درحالیکه پروتئین دارای حداکثر جذب نوری در 280 نانومتر است. بنابراین نسبت جذب نوری در 260 نانومتر/ 280 نانومتر شاخص مناسبی برای ارزیابی آلودگیهای پروتئینی است. چنانچه مقدار این شاخص در دامنه 2-8/1 قرارگیرد، کیفیت RNA مناسب ارزیابی میگردد. برای بررسی بیشتر کیفیت RNA از نسبت جذب نوری 260 نانومتر/ 230 نانومتر استفاده میشود. اما بر خلاف شاخص نسبت میزان جذب نوری در 260 نانومتر/280 نانومتر که بیشتر تحت تاثیر آلایندههای پروتئینی و نوکلئوتیدی تغییر میکند، این شاخص تحت تاثیر تعداد بیشتری از آلایندهها قرار دارد و در نتیجه از دقت کمتری برخوردار است. چنانچه مقدار این شاخص در دامنه 2-7/1 قرارگیرد، کیفیت RNA مناسب ارزیابی میشود [76]. برای بررسی دقیقتر کیفیت RNA از دستگاه بیوآنالیزور 2100[84] و کیت RNA نانو 6000[85] ساخت شرکت اجیلنت تکنولوژیز، لایف ساینسیز[86] استفاده شد. این دستگاه با استفاده از شاخصی به نام RIN [87] کیفیت RNA را نمایش میدهد. این شاخص به منظور استانداردسازی فرایند تفسیر صحت RNA و حذف تفسیرهای شخصی از کیفیت RNA ابداع شده است که روش ازریابی به روش الکتروفورز نیز در آن مدنظر قرار میگیرد. این روش چون بر مبنای تعیین چشمی نسبت ریبوزومی (که از تقسیم زیرواحدهای 18S به 28S به دست میآید) از روی ژل حاصل از الکتروفورز ایجاد میشود، معمولاً با خطا همراه است. در صورتیکه نرمافزار الگوریتمی RIN، علاوه بر اینکه این شاخص را به صورت خودکار تعیین میکند، یک سیستم نمرهدهی از 1 تا 10 ارائه میدهد که در آن 10 دارای بهترین و 1 دارای بدترین کیفیت RNA است (شکل 3-6) [73]. 3-8-3- سنتز cDNA برای سنتز cDNA جهت توالییابی، RNA کل استخراج شده یک نمونه ماهی نر تیمار شده با 17آلفا-استرادیول و همچنین یک نمونه ماهی ماده از ایستگاه چشمهدیمه انتخاب شد. دلیل انتخاب جنس نر، حساسیت بالاتر این جنس به حضور استروژنهای محیطی و در نتیجه افزایش بیان ویتلوژنین در نتیجه تیمار است. حدود 500 نانوگرم از هریک از آنها با استفاده از کیت سنتز cDNA به نام کیواسکریپت[88] ساخت شرکت کوانتا بیوساینسیز[89] بهصورت معکوس رونویسی شد. بهطور خلاصه، واکنش با استفاده از کیو اسکریپت ریاکشن میکس[90] (1X از غلظت نهایی) و کیواسکریپت ریورس ترنسکریپتاز[91] (5/2X از غلظت نهایی) انجام گرفت. برنامه رونویسی معکوس شامل 5 دقیقه در C°22، 30 دقیقه در C°42 و 5 دقیقه در C°85 بود. 3-8-4- همسانهسازی cDNA نسبی ویتلوژنین در P. esfahani آغازگرهای اختصاصی ژن ویتلوژنین از مناطق بسیار باثبات cDNA کامل سایر ماهیان استخوانی طراحی شد (جدول 3-2). PCR با استفاده از 1 واحد بیوتک DNA پلیمراز[92] (ساخت شرکت بیولاین[93])، cDNA، بافر PCR شرکت سازنده (1X از غلضت نهایی)، 5/0 میکرومولار از هر یک از آغازگرهای مستقیم و معکوس، 2/0 میلی مولار dNTPs و 5/1 میلی مولار MgCl2 در حجم نهایی 20 میکرولیتر انجام شد. برنامه PCR شامل 10 دقیقه واسرشتهسازی اولیه در C°95، 35 سیکل تکثیر (واسرشتهسازی به مدت 30 ثانیه در C°95، الحاق به مدت 30 ثانیه در C°4/60 و بسط به مدت 30 ثانیه در C°72 ) و 10 دقیقه بسط نهایی در C°72 توسط دستگاه مسترسایکلر پرواس[94] (ساخت شرکت اپندورف) بود. محصول PCR در ژل آگارز 1% با TBE 1X رنگآمیزی شده با جل رد[95] (ساخت شرکت بیوتیوم[96]) اجرا و توسط سیستم کمیداک ایکس.آر.اس[97] و به کمک نرمافزار ایمیج لب[98] (ساخت شرکت بیورد[99]) قابل رویت شد. محصول PCR توسط کیت نوکلئواسپین جل اند PCR کلین-آپ[100] ( ساخت شرکت مچری-ناجل) تصفیه و به منظور توالییابی با استفاده از کیت کلونینگ توپو-تی.آ[101] (ساخت شرکت اینویتروژن لایف تکنولوژیز[102]) به داخل وکتورpCR®4TOPO® کلون شد. محصول این کیت برای انتقال به سلولهای Escherichia coli و سپس کشت در پلیتهای آگار LB آمپیسیلین به مدت یک شب در C°37 مورد استفاده قرار گرفت. پس از کشت 6 کلون باکتریایی در 3 میلیلیتر از محیط کشت مایع LB آمپیسیلین به مدت یک شب در شیکر C°37، با استفاده از کیت نوکلئواسپین پلاسمید[103] (ساخت شرکت مچری-ناجل) پلاسمید استخراج شد. در هر دو کلون، هر دو رشته توسط آغازگرهای مستقیم و معکوسM13 توالییابی شد. 3-8-5- همسانهسازی cDNA نسبی بتا-اکتین در P. esfahani به منظور حصول توالی اولیه بتا-اکتین در عروسماهی زایندهرود، از آغازگرهای مورد استفاده برای همسانهسازی نسبی ژن بتا-اکتین در Rhamdia quelen (KC195970) استفاده شد (جدول 3-2) [13]. کلیه مراحل PCR، تصفیه، همسانهسازی و توالییابی مطابق با روش بند 3-8-4 انجام گردید. 3-8-6- بسط ویتلوژنین به سمت انتهای َ3از آنجایی که انتظار میرفت فاصله قطعه کوتاه میانی cDNA ویتلوژنین در P. esfahani تا انتهای َ3 آن بسیار طویل باشد، از استراتژی بسط این قطعه به سمت مناطقی از ژنوم که در بین بسیاری از کپورماهیان باثبات بود، استفاده شد. به این منظور، با استفاده از سه آغازگر Nested مستقیم که در انتهای َ3 قطعه ویتلوژنین میانی موجود طراحی شد و 3 آغازگر دژنره[104] معکوس از مناطق باثبات سایر کپورماهیان بهویژه گونههایی که در بلاست[105] قبلی قطعه ویتلوژنین میانی شباهت بیشتری را نشان داده بودند، چندین PCR انجام شد (جدول 3-2). تمام PCRها مطابق با برنامه بند 3-8-4 انجام گرفت. تنها زمان بسط به 2 دقیقه و 30 ثانیه افزایش یافت. پس از هر سه Nested PCR، قطعات در ژل آگارز 1% با TBE 1X اجرا شدند. باندهای دارای اندازه پیشبینی شده از داخل ژل بریده و با استفاده از کیت نوکلئواسپین جل اند PCR کلین-آپ تصفیه شدند. این قطعات با استفاده از کیت کلونینگ جت PCR[106] (ساخت شرکت فرمنتاس لایف ساینسیز[107]) به داخل وکتور pJET1.2/blunt کلون شدند. 3-8-7- تکثیر سریع دوانتهای cDNA (RACE)[108] در ویتلوژنین به منظور همسانهسازی انتهای َ3 در ویتلوژنین، چندین مرحله PCR با 4 آغازگر Nested مستقیم که در انتهای َ3 قطعه طویل شده آن از مرحله قبل طراحی شده بود، در مقابل آغازگرهای معکوس خارجی و داخلی پروتوکل 3’RACE کیت فرست چویش آر.ال.ام-ریس[109] (ساخت شرکت امبیون، لایف تکنولوژیز[110]) انجام شد. با استفاده از آداپتور 3’RACE موجود در کیت، رونویسی معکوس RNA کل صورت گرفت. شرایط PCR مشابه بند 3-8-4 بود. برای کلون انتهای َ5 از پروتوکل 5’RACE کیت مذکور استفاده شد. در این پروتوکل بهطور خلاصه cDNA با استفاده از 1 میکروگرم RNA کل به همراه دسامرهای تصادفی موجود در کیت سنتز گردید. دو مرحله PCR با شرایط مشابه بند 3-8-4 و با استفاده از 2 آغازگر معکوس طراحی شده در انتهای َ5 قطعه cDNA میانی بهدست آمده از مراحل قبلی، انجام گرفت (جدول 3-2). در این واکنشها، آغازگرهای خارجی و داخلی َ5 موجود در کیت به عنوان آغازگر مستقیم استفاده شدند. تمام محصولات حاصل از پروتوکلهای َ3 و َ5 در ژل آگارز 1% اجرا شدند. باندهای دارای اندازه مورد انتظار جدا و تصفیه و به منظور توالییابی با استفاده از کیت کلونینگ توپو-تی.آ به داخل وکتورpCR®4TOPO® کلون شدند. در نهایت هر سه توالی cDNA بدست آمده (َ3، میانی و َ5) با توجه به 100% شباهت در قسمتهای دارای همپوشانی و با استفاده از یک ادغام کننده الگوریتمی (http://pro.genomics.purdue.edu/emboss/) به یکدیگر متصل شدند. 3-8-8- تکثیر سریع دوانتهای cDNA در بتا-اکتین به منظور همسانهسازی انتهای َ3 و َ5 در بتا-اکتین، چندین مرحله PCR با 2 آغازگر Nested که در قطعه میانی آن طراحی شده بود، در مقابل آغازگرهای معکوس خارجی و داخلی پروتوکل َ3 و َ5 ریس کیت فرست چویش آر.ال.ام-ریس مطابق بند 3-8-7 انجام شد. 3-8-9- آنالیز توالیها اطلاعات مربوط به توالیها با استفاده از نرمافزار Chromas Lite (v.2.1) (http://www.technelysium.com.au) رویت، توسط نرمافزارGeneDoc (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/) گردآوری و ادغام [75] و با استفاده از بلاست نوکلئوتید و پروتئین (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) آنالیز شد. برای ترجمه توالی از ORF به آمینواسید از ابزار ترجمه نرمافزار ExPaSy (http://web.expasy.org) استفاده شد. 3-8-10- ترسیم درخت فیلوژنی برای پروتئین ویتلوژنین در عروسماهی زایندهرود پس از همترازی[111] توالی پروتئینی به دست آمده از عروسماهی زایندهرود و سایر توالیهای آمینواسیدی ماهیان و برخی دیگر از مهراداران تخمگذار توسط ClustalW، آنالیزهای فیلوژنیکی و تکاملی توسط نرمافزار MEGA5 انجام گرفت [100]. تاریخچه تکامل با استفاده از روش Neighbor-Joining استنباط شد [86]. تلفیق خودکار درخت، از 1000 تکرار به دست آمد. درصد تکرار درختهایی که در آنها گروه یکسانی از تاکسونها گرد هم آمدند، در کنار شاخهها نشان داده شد [33]. این درخت بر اساس مقیاسی ترسیم گردید که در آن طول شاخهها دارای واحد یکسان با فواصل تکاملی مورد استفاده در استنباط درخت فیلوژنی است. فواصل تکاملی با استفاده از روش اصلاحی Poisson محاسبه شد [112]. این فواصل بر اساس واحدهایی از تعداد آمینواسید های جایگزین در هر جایگاه است. در این آنالیز از 57 توالی آمینواسیدی استفاده شد. تمام جایگاههایی که فاقد اطلاعات یا دارای وقفه در اطلاعات بودند، حذف شدند. مجموعه نهایی دادهها دارای 606 جایگاه متغیر آمینواسیدی بود. 3-8-11- اندازهگیری بیان ژن از طریق PCR کمی (QPCR)[112] رونوشت معکوس استخراج RNA کل و تعیین کیفیت و کمیت آن با استفاده از روش ارائه داده شده در بند 3-8-2 تعیین گردید. تنها نمونههایی از RNA که دارای RIN بالاتر از 7 بودند برای اندازهگیری کمی بیان ژن مورد استفاده قرار گرفتند. کمی سازی با استفاده از سایبر گرین[113] و در دستگاه مسترسایکلر اپگرادیانت اس ریل پلکس 2[114] و نرم افزار Realplex software (v.2.2) (ساخت شرکت اپندورف) انجام گرفت. در این مطالعه، به منظور نرمالسازی واریانس بین دادهها و امکان مقایسه آنها از ژن بتا-اکتین به عنوان ژن کنترل داخلی استفاده شد. با وجود اینکه واریانس بتا-اکتین تحت شرایط آزمایش ما 35/1 CT بود، نتایج بر اساس آن نرمال سازی شد.RNA کل به روشی که قبلا در بند 3-8-3 توضیح داده شد، بهصورت معکوس رونویسی شد. سپس cDNA با استفاده از محلول 10 میلی مولار Tris-HCl و 1/0 میلی مولار EDTANa2 با pH 8.0، 10 برابر رقیق شد. واکنشهایQPCR با 10 نانوگرم از cDNA، 200 نانومولار از هر یک از آغازگرهای مستقیم و معکوس (جدول 3-2) و پرفکتا سایبر گرین فست میکس[115] (ساخت شرکت کوانتا بیوساینسیز) انجام شد. واکنشها درون پلیتهای 10 میکرولیتری سمی-اسکرتد تواین تک Real-time PCR 96[116] (ساخت شرکت اپندورف) پوشیده شده با ادهسیو مسترکلیر Real-time PCR فیلم[117] (ساخت شرکت اپندورف) انجام گرفت. برنامه PCR شامل 5 دقیقه مرحله واسرشتهسازی اولیه و فعالسازی پلیمراز در C°95، 40 سیکل تکثیر (واسرشتهسازی به مدت 15 ثانیه در C°95، الحاق به مدت 30 ثانیه در C°60 و بسط به مدت 30 ثانیه در C°60) و منحنی ذوب نهایی به مدت 20 دقیقه ازC °60 تاC °95 بود. منحنی ذوب به منظور حصول اطمینان از تکثیر تنها یک محصول و عدم وجود محصولات جانبی حاصل از پرایمر دایمر استفاده شد. به علاوه، محصولات PCR در ژل آگارز 2% اجرا و سپس همسانهسازی و توالییابی شدند. توالیهای بهدست آمده با ژنهای موردنظر مطابقت داشتند. بهمنظور بهینه سازی شرایط QPCR، ترکیب مختلف آغازگرها (3 جفت برای بتا-اکتین و 12 جفت برای ویتلوژنین)، دماهای مختلف الحاق (C°60-50) در آغازگرهای انتخاب شده و غلظتهای متفاوت از آغازگرها (100، 200 و 400 نانومولار) و cDNA الگو (5 سری رقیق سازی 10/1 از 10 نانوگرم تا 1 پیکوگرم) استفاده شد. در منحنیهای ذوب حاصل، راندمان تکثیر و r2 برای ویتلوژنین و بتا-اکتین اندازهگیری شد. کمی سازی نسبی ژن با استفاده از روش مقایسه CT (∆∆CT) و مطابق با فرمول ذیل که به صورت خودکار توسط دستگاه محاسبه میشود، انجام گرفت [67]: (3-10)  

 نکته مهم : هنگام انتقال متون از فایل ورد به داخل سایت بعضی از فرمول ها و اشکال (تصاویر) درج نمی شود یا به هم ریخته می شود یا به صورت کد نشان داده می شود ولی در سایت اصلی می توانید فایل اصلی را با فرمت ورد به صورت کاملا خوانا خریداری کنید: سایت مرجع پایان نامه ها (خرید و دانلود با امکان دانلود رایگان نمونه ها) : jahandoc.com   در این رابطه، R بیان کمی ژن و CT شماره سیکل آستانه تشخیص نور فلورسنت توسط دستگاه است که با میزان cDNA هدف همبستگی منفی دارد. یعنی هرچه میزان ژن هدف بیشتر باشد تعداد سیکل لازم برای رسیدن به حد آستانه تشخیص توسط دستگاه کاهش مییابد. Sample نمونه مورد آزمایش و Calibrator نمونهای است که بیان ژن مورد نظر در نمونه نسبت آن توصیف میشود. در این مطالعه، نمونه شماره 4 از ایستگاه چشمهدیمه با جنسیت ماده به عنوان نمونه کالیبراتور انتخاب شد. معیار این انتخاب، جنسیت ماده و بنابراین اطمینان از وجود mRNA ویتلوژنین، بالا بودن غلظت RNA و داشتن RIN مناسب بود. منظور از Housekeeping gene، ژن کنترل داخلی است. این ژنها، کدکننده پروتئینهای لازم برای عملکردهای اساسی سلول هستند که معمولاً در بافتهای مختلف به یک میزان بیان میشوند. شرط اصلی و لازم در انتخاب این ژن، ثابت بودن میزان بیان آن تحت شرایط آزمایش است. در این مطالعه، ژن بتا-اکتین به عنوان ژن کنترل داخلی انتخاب شد. جدول 3-2) اولیگونوکلئوتیدهای طراحی شده برای حصول قطعات مورد نظر و آنالیز QPCR در ویتلوژنین و بتا-اکتین. آغازگر جهت توالی (5’-3’) موقعیت تکثیر قطعات حدواسط slVTG-Fمستقیم GACMSARAACACCTTYMTGATG 203 a slVTG-F مستقیم TGACCAGCATTGCCCAKAAC 1480 a slβactin-F مستقیم ACCACAGCYGARMGKGAAAT 699 b slβactin-R معکوس TCCKGTCWGCRATGCCAGGGT 1018 b بسط ویتلوژنین به سمت انتهای3 slVTG-3’-F1 مستقیم TCTTCAGACCCCCATTCAACT 893 a